背景:姜黃素(Curcumin)是從植物姜黃中分離出來具有抗炎、抗氧化等多種藥理活性的天然多酚,具有潛在的臨床價值。因姜黃素水溶解性差,口服生物利用度低,極大限制其臨床應用。我們通過構建聚乙二醇修飾后的姜黃素衍生物(Curc-mPEG454),明顯改善姜黃素的水溶性和生物利用度。前期研究證實Curc-mPEG454減輕肝纖維化程度與顯著抑制環(huán)氧合酶2(COX-2)表達密切相關。因此,本研究采用脂多糖(LPS)誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7作為炎癥模型,以姜黃素、阿司匹林、NS-398和維生素C做對照,在體外系統(tǒng)評估Curc-mPEG454抗炎和抗氧化活性,并闡明其可能的分子作用機制。材料與方法:1.細胞模型和分組:用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7小鼠巨噬細胞,待細胞狀態(tài)良好時將細胞分為七組:正常對照組,LPS模型組,CurcmPEG454(16μM),姜黃素(16μM),阿司匹林(100μM),NS-398(50μM)和維生素C(300μM)預處理2h,隨后,除正常對照組外,其余各組均用1μg/ml脂多糖(LPS)刺激細胞24小時。2.炎癥因子的檢測:ELISA檢測各組細胞上清中炎癥因子的含量,包括白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、一氧化氮(NO)。熒光定量PCR(Real-Time PCR)檢測環(huán)氧合酶-2(COX-2)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、白細胞介素1β(IL-1β)和一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA的表達水平。Western Blot檢測COX-2和iNOS的蛋白表達水平。3.ROS的檢測:DCFH-DA標記細胞內的ROS,使用激光共聚焦和流式細胞術檢測各組細胞活性氧類的(ROS)水平。4.抗氧化活性的檢測:的蛋白和mRNA的表達。酶活性檢測試劑盒和PCR檢測了細胞中抗氧化酶類,包括血紅素加氧酶(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)酶的活性以及他們的mRNA表達水平。5.核轉錄因子的檢測:Real-Time PCR和Western Blot分別檢測(NF-κB),-c-Jun的核蛋白和mRNA的表達水平,同時應用激光共聚焦技術檢測NF-κB p65的和轉位情況和p-c-Jun核內表達的情況。6.統(tǒng)計所有實驗數據,以平均數±標準差表示,采用SPSS19.0軟件中的單因素方差分析組間數據是否具有差異性,當P0.05認為組間差異具有統(tǒng)計學意義。結果:1.Curc-mPEG454抑制炎癥介質的釋放:Curc-mPEG454(IC50 57.8μM)與姜黃素(IC50 32.6μM)相比,其細胞毒性較低,并呈濃度依賴性抑制炎性細胞因子IL-6,TNF-α,IL-1β和MCP-1的釋放。在相同濃度下,16μM CurcmPEG454也顯示出比姜黃素更強的對炎癥細胞因子的抑制作用(P0.05)。2.Curc-mPEG454顯著下調COX-2表達,減少PEG2生成:LPS誘導升高細胞COX-2的表達量,而Curc-mPEG454(16μM)最能夠抑制COX-2蛋白和mRNA的表達繼而抑制前列腺素E2(PGE2)的產生,卻不影響COX-2酶的活性。阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)能夠明顯降低PGE2的水平,主要通過抑制COX-2酶的活性但并不顯著改變COX-2的表達水平。3.Curc-mPEG454抑制NF-κB p65核轉位和降低p-c-jun水平。在模型組中LPS誘導細胞內NF-κB p65核轉位和p-c-jun的表達水平升高,與模型組比較,細胞核內的熒光結果顯示Curc-mPEG454(16μM)明顯減少LPS誘導的NF-κB p65核轉位和p-c-jun磷酸化水平。而阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)輕微減少了NF-κB p65核轉位和p-c-jun的表達水平。Curc-mPEG454降低LPS誘導的NF-κB p65核轉位和p-c-jun的表達水平是最為明顯的。4.Curc-mPEG454抑制LPS誘導的iNOS表達,NO和ROS產生:CurcmPEG454(16μM)能明顯降低LPS誘導的iNOS的產生并抑制NO和ROS的生成,而阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)則并不能降低LPS誘導的ROS和NO的產生。而Curc-m PEG454(16μM)和Curcumin(16μM)的抑制效果基本相同。5.Curc-mPEG454通過激活Nrf2及下游抗氧化酶類發(fā)揮抗氧化作用:CurcmPEG454(16μM)在6h、12h、24h三個時間點對Nrf2核蛋白和mRNA的表達呈先升高后下降的趨勢。在炎癥的早期,Curc-mPEG454(16μM),Curcumin(16μM)和維生素C(300μM)能夠通過激活Nrf2,升高其下游的抗氧化酶類HO-1,GSH,SOD,CAT的活性,而阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)并不能升高Nrf2的表達和其下游的抗氧化酶的活性。Curc-mPEG454具有和Curcumin、維生素C等同的抗氧化能力。結論:Curc-mPEG454通過抑制NF-κB p65核移位,抑制c-Jun磷酸化和抑制COX-2的表達發(fā)揮抗炎作用。其次,Curc-mPEG454通過增加Nrf2的表達,升高其下游的HO-1,GSH,SOD,CAT等抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化作用。聚乙二醇化姜黃素不僅改善姜黃素的水溶性,提高其生理活性,而且作用于炎癥反應和抗氧化反應的的多個靶點,其抗炎效果優(yōu)于阿司匹林和NS-398,抗氧化能力等同維生素C。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1. 姜黃素和聚乙二醇化姜黃素衍生物Figure 1.The chemical structure of Curcumin and Curc-mPEG454主要實驗試劑 供應商姜黃素 Sigma-AldrichLPS Sigma-Aldrich維生素 C Sigma-Aldrich阿司匹林 Sigma-AldrichNS398 Cayman chemical氯仿 重慶醫(yī)科大學設備與試劑中心甲醇 重慶醫(yī)科大學設備與試劑中心10 X loading buffer TaKaRaRnase-free 水 TaKaRaDMEM Gibco（美國）胎牛血清 Gibco（美國）雙抗(PS) 實驗室配制0.25%胰蛋白酶 實驗室配制

圖 2. Curc-mPEG454 對 RAW264.7 細胞活力的影響。Figure. 2 Effects of Curc-mPEG454 on RAW264.7 cell viability. Cells were pretreated wiincreasing concentrations of Curc-mPEG454 or curcumin for 2h, then incubated in medcontaining LPS (1μg/mL) for 24h at 37℃. Cell viability was determined by using acolorimetric MTT assay. The data shown represent the mean ±SD, from three independeexperiments..2 Curc-mPEG454抑制LPS誘導的促炎細胞因子姜黃素具有較好的抗炎能力可能是通過其抑制炎癥前細胞因子如腫瘤壞子（TNF-α），白細胞介素（IL）-1,6，環(huán)氧合酶-2（COX-2）和誘導型一氮合酶（iNOS）[17]。在這里，我們研究了Curc-mPEG454對LPS激活AW264.7細胞中幾種關鍵炎癥因子IL-1，IL-6，TNF-α和MCP-1的抑制作用姜黃素（16μM），阿司匹林（100μM）[18]和NS-398（50μM）相比[19]。如A，B所示，Curc-mPEG454以濃度依賴性方式抑制IL-6和TNF-α的炎癥因子

19圖3. Curc-mPEG454對LPS誘導的炎性細胞因子產生的影響。Figure. 3 Effects of Curc-mPEG454 on LPS-induced inflammatory cytokineproduction.RAW264.7 cells were pretreated with indicated concentrations of Curc-mPEG454, curcumin, aspirin and NS-398 for 2h, and then were activated with 1μg/mL LPSfor 24h. Cell culture media was collected and analyzed for IL-6 (A) and TNF-α (B) levelsusing ELISA kit. Gene expression of IL-1β (C) and MCP-1 (D) was calculated usingcomparative cycle threshold (CT) method normalized to the house keeping gene GAPDH.The data shown represent mean ±SD, from three independent experiments.###P < 0.001vscontrol group; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001vs model group.3.3 Curc-mPEG454抑制LPS誘導的COX-2表達和前列腺素E2的合成姜黃素與NSAIDs均能抑制前列腺素（PGs）合成起到對抗炎癥的作用[20]。環(huán)氧合酶（COX）是負責將花生四烯酸轉化為PGs的關鍵酶。越來越多的證據表

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 黃小華;孫永;沈能;唐華東;任紅;彭明利;;雙親姜黃素衍生物減輕大鼠肝纖維化與抗炎抗氧化作用的研究[J];中國藥理學通報;2015年04期

2 楊正生;彭振輝;李曉莉;宋健文;任建文;;姜黃素對IL-17誘導的人角質形成細胞NO合成以及iNOS表達的影響[J];細胞與分子免疫學雜志;2011年09期

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4 Wai K．Leung;Ka-Fai To;Alfa H．C．Bai;Po-Ki Ma;Minnie Y.Y.Go;Joseph J．Y．Sung;;Different cell kinetic changes in rat stomach cancer after treatment with celecoxib or indomethacin: Implications on chemoprevention[J];World Journal of Gastroenterology;2005年01期

本文編號：2813849