苔類植物是最早的陸生植物群,為了適應干旱的陸地環(huán)境,體內產生了豐富的次級代謝產物(包括聯(lián)芐、萜類、木脂素類、香豆素和黃酮類等化合物)。黃酮類化合物具有重要的生理活性,在植物應對生物和非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用。該類化合物在母核形成之后可發(fā)生多種修飾反應包括甲基化、糖基化和�；�,因此種類繁多。黃酮是苔類植物中常見的成分,不同類別的黃酮已被分離鑒定,其中包含甲基化和糖基化的黃酮。黃酮甲基化反應由植物氧甲基轉移酶(O-methyltransferases,OMTs)參與催化,將S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)提供的甲基基團轉移到黃酮羥基上。OMTs 一般分為兩類:Class Ⅰ OMTs 和 Class Ⅱ OMTs。Class Ⅰ OMTs也稱為咖啡酰輔酶A氧甲基轉移酶(Caffeoyl CoA O-methyltransferases,CCoAOMTs),分子量一般在23-29 KDa,酶活反應需要Mg2+的參與,特異性催化脂酰輔酶A,其亞類CCoAOMT-like可催化香豆素和黃酮等多種化合物。ClassⅡOMTs分子量較大,且不需要金屬離子參與催化,該類酶稱為咖啡酸氧甲基轉移酶(Caffeic　acid　O-methyltransferases,COMTs),催化底物包括咖啡酸、香豆素、生物堿和各種黃酮等化合物。本文從鈍鱗紫背苔(Plagiochasma　appendiculatu 的轉錄組測序數(shù)據(jù)庫篩選出四個注釋為COMT的基因,分別命名為PaF4'OMT,PaCOMT2,PaCOMT3和PaCOMT4。經序列比對發(fā)現(xiàn),PaF4'OMT比來自其他植物的COMTs長約27個氨基酸。將蛋白長的N端截掉并命名為PaCOMT1-Tr。進化分析表明,四個目的基因都屬于Class Ⅱ OMTs,位于黃酮氧甲基轉移酶的根部。從植物中克隆出目的基因全長,構建到蛋白表達載體上,經IPTG誘導蛋白表達后用Ni柱分離純化蛋白。酶活結果顯示,PaF4'OMT可以催化一系列黃酮生成B環(huán)對位羥基甲基化產物,而不能催化苯丙素類化合物。其最適底物是芹菜素,可被催化生成金合歡素。PaCOMT1-Tr也具有催化活性,但反應效率和底物選擇性低于PaF4'OMT,說明在植物體內真正起作用的是PaF4'OMT。PaCOMT2-4不具有催化活性。金合歡素是一種重要的化合物,具有多種藥用價值,通過芹菜素甲基化的方式生成金合歡素,構建了含有PaF4'OMT的工程菌株,利用工程菌株發(fā)酵的方法獲得該化合物。這是第一次從苔類植物中鑒定出二類氧甲基轉移酶。實驗室前期從粗裂地錢(Marchantia paleacea)和鈍鱗紫背苔中克隆并鑒定了兩個氧甲基轉移酶,分別為MpOMT和PaF6OMT。序列比對和進化樹分析結果表明它們屬于Class ⅠOMTs,但與經典OMTs序列相似性低,在進化關系上與動物兒茶酚氧甲基轉移酶聚為一簇。為了研究該類基因是否在苔類植物中普遍存在以及在進化過程中的關系,用MpOMT序列搜索楔瓣地錢(Marchantia emarginata)和圓葉裸蒴苔(Haplomitrium mnioides)的轉錄組數(shù)據(jù)庫,找到兩個CCoAOMTs并分別命名為MeOMT和HmOMT。這兩個基因在進化地位上與MpOMT和PaF60MT 一致。MeOMT、HmOMT和MpOMT具有相似的催化特性,可反應多種底物,催化效率高,最適底物是秦皮乙素,而PaF60MT主要催化黃芩素和野黃芩素C-6位羥基的甲基化。MeOMT、HmOMT、MpOMT和PaF60MT具有很高的序列相似性,但是催化特點不同。為了研究與底物催化有關的關鍵氨基酸,對MpOMT和PaF60MT進行了點突變,發(fā)現(xiàn)PaF60MT中第59位的精氨酸有利于黃芩素和野黃芩素的C-6位羥基的甲基化。底物飼喂實驗表明基因在載體上的連接位置、底物濃度等均可影響產物的產量,并提出一種新的生產千層紙素A和東莨菪內酯的方法。黃酮苷類化合物由糖基轉移酶(Uridine diphosphate glycosyltransferases,UGTs)催化生成,糖基轉移酶將UDP活化的糖基供體轉移到黃酮類化合物形成糖苷。黃酮的糖基化有利于化合物轉運和代謝。為了研究苔類植物中UGTs的催化特點和功能,本文從鈍鱗紫背苔的轉錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出三個注釋為UGT的基因,分別命名為PaUGT1、PaUGT2和PaUGT3。經序列比對發(fā)現(xiàn),PaUGTs序列與其他植物的UGTs差異較大,但C端的PSPG序列相似性高,關鍵氨基酸保守。進化樹分析表明三個基因同屬于一簇,和其他植物黃酮7-O-GTs屬于同一進化枝。將三個基因從鈍鱗紫背苔中克隆出來,構建入原核表達載體,并用UDP-葡萄糖作為糖基供體進行了體外酶活反應,結果顯示PaUGT1是黃酮7位糖基轉移酶,催化芹菜素、木樨草素、槲皮素和山奈酚四種底物生成黃酮7-O-葡萄糖苷。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R284
【部分圖文】：

０．５逡逑圖２．２邋ＰａＣＯＭＴｓ系統(tǒng)發(fā)生進化樹分析逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．２邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＰａＣＯＭＴｓ．逡逑Ｔｈｅ邋ｓｃａｌｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ邋ｄｉｓｔａｎｃｅ．邋Ｔｈｅ邋ｎｕｍｂｅｒｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ａｒｅ邋ｂｏｏｔｓｔｒａｖａｌｕｅｓ，邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋１，０００邋ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．邋ＩＯＭＴ，邋ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ邋Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；邋ＤＯＭＴ

圖２．４邋ＰａＦ４＇ＯＭＴ對不同底物的相對催化活性逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋ＰａＦ４’ＯＭＴ邋ｔｏｗａｒｄｓ邋ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．（見實逡逑驗記錄邋０００３３８５邋Ｐ６７）逡逑

圖２．６溫度和ｐＨ對催化效率的影響逡逑Ｆｉｕｒｅ邋２．６邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｖａｒｉｎｔｈｅＨ邋ａｎｄ邋ｔｅｍｅｒａｔｕｒｅ邋ｏｎ邋ｅｎｚｍｅ邋ａｃｔｉｖｉｔ．（

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本文編號：2813369