研究背景類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是指以滑膜關(guān)節(jié)中的慢性炎癥為特征的,慢性和系統(tǒng)性自身免疫性疾病。成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)在軟骨破壞中發(fā)揮重要作用。激活的RA FLSs與腫瘤細(xì)胞具有多種生物學(xué)特性,并通過(guò)積極增殖和抗凋亡而在血管翳形成中發(fā)揮重要作用,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)骨和軟骨的破壞。因此,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯在RA中發(fā)揮治療作用。斷藤益母湯是導(dǎo)師治療RA系列經(jīng)驗(yàn)方之一,在臨床抗RA治療中有確切療效,但其物質(zhì)基礎(chǔ)尚未闡明。課題組前期已采用UFLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)結(jié)合血清藥物化學(xué)方法分析斷藤益母湯的活性成分,初步篩選出山柰酚(Kaempferol)為可能活性成分之一。山柰酚是一種黃酮類(lèi)化合物,既往研究表明其具有抗癌、抗炎、抗氧化等多種藥理學(xué)作用,但對(duì)于誘導(dǎo)RA FLSs凋亡和周期阻滯作用的研究,至今國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。由于山柰酚對(duì)于腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎以及其抗菌活性及其涉及的調(diào)節(jié)機(jī)制與炎癥及免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān),因此本研究推測(cè):山柰酚對(duì)RA異常生物學(xué)行為也具有調(diào)控作用。為此,該論文選擇斷藤益母湯中抗炎活性成分較好的山柰酚進(jìn)行深入研究,分別在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型和動(dòng)物模型上系統(tǒng)的考察了藥物的療效,并從分子水平上闡明了藥物作用的機(jī)制,確定了藥物作用的靶點(diǎn),這不僅為山柰酚治療RA提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù),還將為斷藤益母湯的“多成分—多靶點(diǎn)—多途徑”整合機(jī)制研究,為其臨床應(yīng)用,為中藥復(fù)方研究的現(xiàn)代化提供科學(xué)依據(jù),為研發(fā)RA創(chuàng)新藥物奠定基礎(chǔ)。一、山柰酚誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡和周期阻滯作用的研究目的:1.培養(yǎng)和鑒定RA FLSs。2.研究山柰酚對(duì)RA FLSs生長(zhǎng)形態(tài)、生存率及增殖率的影響3.研究山柰酚誘導(dǎo)RA FLSs凋亡和周期阻滯的作用。方法:收集符合美國(guó)ACR 1987年RA診斷標(biāo)準(zhǔn)的9例患者,通過(guò)膝關(guān)節(jié)鏡下滑膜切除術(shù)或膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)后取得其滑膜組織,采用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)一步分離培養(yǎng)成滑膜成纖維細(xì)胞(RA FLSs)。采用光學(xué)顯微鏡觀察體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)。采用細(xì)胞免疫熒光法對(duì)FLS中特異表達(dá)的vimentin蛋白進(jìn)行鑒定。用不同濃度的山柰酚處理細(xì)胞后,采用CCK-8法檢測(cè)山柰酚對(duì)RA FLSs細(xì)胞生存率的影響,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,采用EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖率,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率及周期阻滯情況。結(jié)果:光學(xué)顯微鏡下觀察體外分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞,組織貼壁后5-7天可見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)型細(xì)胞從組織邊緣爬出,逐漸增多呈放射狀。3～4周后漸覆蓋瓶底70%～80%。3代后細(xì)胞類(lèi)型逐漸純化,細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型,胞核卵圓形居中,形態(tài)與FLSs相符。采用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞表達(dá)vimentin高表達(dá),根據(jù)以上結(jié)果,本研究認(rèn)為本研究培養(yǎng)的細(xì)胞為RA FLSs。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:使用25μM、50μM、100μM、200μM山柰酚和20μMMTX處理RA FLSs 24h,細(xì)胞活力下降。和空白對(duì)照組比較,山柰酚組(100μM、200μM)和MTX組RA FLSs的細(xì)胞活力顯著下降(P0.05或P0.01),故后續(xù)應(yīng)用100μM、200μM的山柰酚和20μM MTX干預(yù)RA FLSs研究。EdU法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:經(jīng)過(guò)100μM、200μM的山柰酚和20μMMTX干預(yù)后,RA FLSs增殖率相對(duì)于空白對(duì)照組顯著下降(P0.05或P0.01),且呈濃度依賴(lài)性,提示山柰酚和MTX可抑制RA FLSs的增殖。凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組比較,山柰酚組和MTX組凋亡率增加(P0.05或P0.01),提示山柰酚和MTX可誘導(dǎo)RA FLSs發(fā)生凋亡。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組比較,山柰酚組和MTX組的G0/G1期細(xì)胞比例上升(P0.05或P0.01),S期的細(xì)胞比例無(wú)顯著變化(P0.05),而G2/M期細(xì)胞比例顯著下降(P0.05或P0.01)。其中,在山柰酚200μM高劑量干預(yù)組中,G0/G1期的細(xì)胞增加約34%和G2/M期的細(xì)胞減少約32%。提示山柰酚和MTX可誘導(dǎo)G0/G1期的RA FLSs生長(zhǎng)阻滯。結(jié)論:山柰酚抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)RA FLSs凋亡和周期阻滯。因此,山柰酚可能具有治療RA的治療潛力。二、山柰酚誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡和周期阻滯的分子機(jī)制研究目的:研究山柰酚誘導(dǎo)RA FLSs凋亡和周期阻滯的分子信號(hào)機(jī)制。方法:取培養(yǎng)至3-5代并經(jīng)過(guò)鑒定的RA FLSs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK4表達(dá)水平和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9表達(dá)水平以及,以及PI3K、Akt及其磷酸化水平。免疫印跡法檢測(cè)PI3K抑制劑(LY294002)對(duì)RA FLSs周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PI3K抑制劑(LY294002)對(duì)細(xì)胞凋亡和周期阻滯的影響。結(jié)果:免疫印跡法顯示,山柰酚干預(yù)組中,凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及PI3K和Akt蛋白磷酸化表達(dá)水平明顯降低(P0.05或P0.01),Bax、Cleaved Caspase 3和Cleaved Caspase 9表達(dá)水平上升(P0.05或P0.01)。PI3K蛋白抑制劑(LY294002)干擾后增強(qiáng)了山柰酚對(duì)RA FLSs的作用:與山柰酚組比較,LY294002聯(lián)合山柰酚組細(xì)胞活力和凋亡率均下降;Bcl-2及Akt蛋白磷酸化表達(dá)水平明顯降低(P0.05),Bax、CleavedCaspase3和Cleaved Caspase 9表達(dá)水平上升(P0.05)。免疫印跡法顯示,山柰酚干預(yù)組中,細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶4(cyclin dependent kinase,CDK4)表達(dá)水平下降(P0.05或P0.01)。PI3K蛋白抑制劑(LY294002)干擾后增強(qiáng)了山柰酚對(duì)RA FLSs的作用:與山柰酚組比較,LY294002聯(lián)合山柰酚組或者G0/G 1期的細(xì)胞比例上升,而G2/M期的細(xì)胞比例顯著下降(P0.05);Cyclin D1和CDK4表達(dá)水平均下降(P0.05)。結(jié)論:山柰酚可以通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)RA FLSs凋亡和周期阻滯。三、山奈酚對(duì)小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的治療作用目的:觀察山柰酚對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)炎模型的治療作用。方法:48只SPF級(jí)DBA/1雄性小鼠,7-8周齡,實(shí)驗(yàn)分組:模型組,山柰酚(高、中、低劑量)組,甲氨蝶呤組(MTX)。以正常小鼠作為正常對(duì)照組,以MTX為陽(yáng)性對(duì)照。每組樣本量為8只。應(yīng)用經(jīng)典的RA模型—膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型,實(shí)驗(yàn)各組在RA小鼠模型第二次免疫時(shí)即在造模第21天開(kāi)始給予相應(yīng)的處理,山柰酚(高、中、低劑量)組,分別給予山柰酚200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg,每天灌胃1次,連續(xù)28天。甲氨蝶吟(MTX)組,參照文獻(xiàn)方法,給予2mg/Kg,每3天灌胃1次,連續(xù)9次。模型組和正常對(duì)照組給予等體積溶媒,每天灌胃1次,連續(xù)28天。每4天觀察檢測(cè)小鼠一般情況,并進(jìn)行小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分。檢測(cè)指標(biāo):計(jì)算脾指數(shù)、踩關(guān)節(jié)采用HE染色觀察其病理變化和采用熒光Tunel法檢測(cè)滑膜細(xì)胞的凋亡情況、ELISA法檢測(cè)血清IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)量。結(jié)果:動(dòng)態(tài)評(píng)估小鼠關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度:與模型組比較,給藥9天后山柰酚高劑量組小鼠關(guān)節(jié)炎得分顯著下降(P0.05或P0.01),給藥13天后山柰酚中劑量組和MTX組小鼠關(guān)節(jié)炎得分亦明顯下降(P0.05),山柰酚低劑量組小鼠關(guān)節(jié)炎得分雖有下降趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。脾指數(shù):與正常組比較,模型組小鼠脾指數(shù)有升高趨勢(shì)(P0.01),與模型組比較,各治療組小鼠脾指數(shù)有下降趨勢(shì),且山柰酚高劑量和MTX組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。實(shí)驗(yàn)各組小鼠血清炎癥因子改變:造模后,模型組較正常組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)明顯上升(P0.05或P0.01)。與模型組比較,各治療組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)降低,山柰酚高、中劑量組和MTX組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)顯著降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05或P0.01)。實(shí)驗(yàn)各組小鼠踝關(guān)節(jié)HE染色病理學(xué):模型組滑膜細(xì)胞增生顯著、排列雜亂,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞;各治療組小鼠關(guān)節(jié)滑膜增生減輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,骨質(zhì)破壞范圍縮小,部分關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)有所修復(fù)。與模型組比較,各治療組小鼠病理學(xué)評(píng)分有下降趨勢(shì),山柰酚高、中劑量組和MTX組病理學(xué)評(píng)分顯著下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)各組小鼠踝關(guān)節(jié)TUNEL染色病理學(xué):與模型組比較,各治療組小鼠滑膜細(xì)胞凋亡率有上升趨勢(shì),山柰酚高、中劑量組和MTX組滑膜細(xì)胞凋亡率顯著上升具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05或P0.01)結(jié)論:山柰酚能有效緩解CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀,抑制滑膜炎癥、關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)破壞。山柰酚對(duì)RA的滑膜炎癥以及隨后的關(guān)節(jié)破壞均有一定的治療作用。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R285.5
【部分圖文】：

Ｖ陽(yáng)，ＰＩ陽(yáng)和蛋Ｖ胞的百分比。逡逑學(xué)分析逡逑數(shù)據(jù)用ＳＰＳＳ２０．０統(tǒng)計(jì)軟件處理，定量資料用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差土ｓ）比較用ｔ檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用Ｏｎｅ邋—Ｗａｙ邋ＡＮ０ＶＡ分析，兩兩比果數(shù)據(jù)為非正態(tài)性分布，采用Ｋｒｕｓｋａｌ邋—邋Ｗａｌｌｉｓ秩和檢驗(yàn)。／＜０．邋０５意義。逡逑邋ＦＬＳｓ的培養(yǎng)和鑒定逡逑顯微鏡下觀察，組織貼壁后５－７ｄ可見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)型細(xì)胞從組織邊緣爬出，逐（圖１Ａ）。３？４周后漸覆蓋瓶底７０％？８０％。３代后細(xì)胞類(lèi)型逐漸純型，胞核卵圓形居中，形態(tài)與ＦＬＳｓ相符（圖１Ｂ）。Ｖｉｍｅｎｔｉｎ是ＦＬＳ中蛋白，采用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞表達(dá)ｖｉｍｅｎｔｉｎ邋Ｃ圖１Ｃ），根據(jù)宄認(rèn)為本研宄培養(yǎng)的細(xì)胞為ＲＡ邋ＦＬＳｓ。逡逑

ＣＣＫ－８實(shí)驗(yàn)研宄山柰酚和ＭＴＸ對(duì)ＲＡＦＬＳｓ細(xì)胞活力的確定本實(shí)驗(yàn)中山柰酚和ＭＴＸ的實(shí)驗(yàn)濃度。ＣＣＫ－８實(shí)驗(yàn)ｌＯＯｐＭ、２００ｐＭ山柰酚和２０｜ｉＭ邋ＭＴＸ處理ＲＡＦＬＳｓ２４ｈ，較，山柰酚組（１００｜＿ｉＭ、２０Ｃ＾Ｍ）和ＭＴＸ組ＲＡＦＬＳｓ尸＜０．０１）（表２，圖２）；山柰酚組（２００｜＿ｉＭ）和ＭＴ山柰酚和ＭＴＸ可抑制ＲＡＦＬＳｓ的活力，且與藥物濃度顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故后續(xù)應(yīng)用ｌ0（ＶＭ、２Ｃ％Ｍ的Ｓｓ做后續(xù)實(shí)驗(yàn)研宄。逡逑表２山柰酚對(duì)ＲＡ邋ＦＬＳｓ活力的影響（Ｉ邋土ｓ）逡逑組別邐Ｎ邐２４小時(shí)抑制率（％）逡逑空白組邐３邐１００．７０邋＋邋７．邋０２逡逑山柰酚組（２５１４１）邐３邐９２．４７±１２．１０逡逑山柰酚組（５０ＭＭ）邐３邐８３．６６±１２．邋１０逡逑山柰酚組（１００蝴）邐３邐７４．６６±９．０８＊逡逑山柰酚組（２００剛）邐３邐４９．８９±９．５（Ｔ逡逑ＭＴＸ組（２０ＭＭ）邐３邐７０．邋６７±５．邋４５＊逡逑與空白組比較，‘Ｋ0＿邋０５，＊＊／＂＜０．邋０１；與ＭＴＸ組比較，△代０．０５１２０－１逡逑

逡逑ＦＬＳｓ的增殖（表３，圖３和４）。逡逑Ｋａｃｍｐｆｃｒｏｌ（ｆｉＭ）逡逑Ｃ邋ｔｒｌ邐１００邐２００邋Ｍ邋ｒＸ（２０ｊ＾Ｍ）逡逑■ＭＢ逡逑■ＩＢ逡逑圖３山柰酚對(duì)ＲＡ邋ＦＬＳｓ增殖的影響（Ｘ２００）逡逑表３山柰酚對(duì)ＲＡ邋ＦＬＳｓ增殖的影響（Ｉ邋土ｓ）逡逑＾邋組別邐Ｎ邐增殖率逡逑空白組邐３邐４９．邋１６±８．８９逡逑山柰酚組（１００ＭＭ）邐３邐２８．邋４８±８．邋０６＊逡逑山柰酚組（２００剛）邐３邐１４．邋８６邋±７．邋５５＊＊逡逑１ＭＴ）（組（２０ＭＭ）邐３邋２ｆｉ．邋３４±５．８７＊逡逑注：與空白組比較，＊Ｋ0．邋０５，邋＊＊尸＜０．邋０１。逡逑６０－逡逑．邋｜Ｅ邋娭邋＿逡逑ｓ邋叫邋＿邋＿邋＿邋＿逡逑Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ邋（ｊｉＭ邋）邋－邐１００邐２００邐－逡逑ＭＴＸ邋（ＭＭ邋）邐２０逡逑圖４山柰酚對(duì)ＲＡ邋ＦＬＳｓ增殖的影響Ｇ邋土邋ｓ）逡逑（四）山柰酚對(duì)ＲＡ邋ＦＬＳｓ凋亡的影響逡逑為了調(diào)查山柰酚是否有影響對(duì)ＲＡＦＬＳｓ的凋亡，本研究使用了ＡｎｎｅｘｉｎＶＶ－ＦＩＴＣ邋／逡逑ＰＩ雙染色以評(píng)估百分比的變化凋亡細(xì)胞。結(jié)果顯示，山柰酚和ＭＴＸ組均引起了顯著的逡逑影響ＲＡＦＬＳｓ凋亡增加，呈劑量依賴(lài)性方式。與空白對(duì)照組比較，山柰酚和ＭＴＸ可顯著逡逑誘導(dǎo)ＲＡＦＬＳｓ發(fā)生凋亡（ＰＣ０．０５或尸＜０．０１），山柰酚組（２００＾Ｍ）和ＭＴＸ組之間比較具逡逑有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示山柰酚和ＭＴＸ可誘導(dǎo)ＲＡＦＬＳｓ發(fā)生凋亡（表４，圖５和６）。逡逑２６逡逑

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