【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,金葡菌)是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的主要病原菌,致病性較強(qiáng)。由于抗生素及其他抗菌藥物的選擇性壓力,金葡菌形成多種耐藥性策略。耐藥性病原菌的進(jìn)化及蔓延,尤其是超級(jí)耐藥菌株的出現(xiàn),對(duì)感染性疾病的治療以及人類(lèi)的健康提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此,當(dāng)務(wù)之急是尋找并研發(fā)治療細(xì)菌感染的新策略。金葡菌致病性的強(qiáng)弱主要取決于其所產(chǎn)生的各種毒力因子。金葡菌血管性血友病因子結(jié)合蛋白(vWbp)是影響金葡菌致病性的重要毒力因子,可將血液或者血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白,沉積于菌體表面,加速凝血過(guò)程,同時(shí)形成的纖維蛋白屏障可抵抗宿主自身免疫系統(tǒng)的清除,促使感染局限化形成膿腫病灶以及血栓形成。此外,vWbp可促進(jìn)金葡菌在導(dǎo)管表面的黏附以及腎膿腫形成。因此,以vWbp為抗毒力靶點(diǎn),開(kāi)展相關(guān)抑制劑的研究具有重要意義。抗毒力化合物與傳統(tǒng)的抗菌藥物截然不同,不影響細(xì)菌本身的生長(zhǎng)活性,主要通過(guò)靶向金葡菌的毒力因子從而降低病原菌致病性�？苟玖衔锟墒骨秩氲募�(xì)菌處于易感狀態(tài),從而增強(qiáng)宿主自身的免疫清除作用和抗菌或殺菌活力。綿馬貫眾素是從鱗毛蕨科植物綿馬貫眾(Dryopteris crassirhizoma Nakai)根莖和葉柄中分離出的一種間苯三酚衍生物,具有驅(qū)蟲(chóng)、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理作用,還具有抗菌活性。但對(duì)于其能否通過(guò)影響vWbp活性,影響金葡菌致病性仍不可知。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本實(shí)驗(yàn)以金葡菌vWbp為藥物作用靶點(diǎn),從200種中藥單體中篩選出其有效抑制劑即綿馬貫眾素,并研究該抑制劑對(duì)vWbp蛋白活性及金葡菌體外導(dǎo)管感染模型和金葡菌感染小鼠腎膿腫的影響。從而為以vWbp作為治療靶點(diǎn),通過(guò)綿馬貫眾素降低金葡菌致病力提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法:1.本研究首先構(gòu)建含有vWbp基因的過(guò)表達(dá)載體vWbp-p ET15b,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),并用Ni柱親和層析純化目的蛋白;2.vWbp抑制劑篩選:通過(guò)金葡菌試管凝血實(shí)驗(yàn),從200種中藥單體中篩選無(wú)明顯抑菌活性的vWbp抑制劑,選取抑制效果較好的中藥單體即綿馬貫眾素作為后期實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象;3.通過(guò)繪制綿馬貫眾素作用下金葡菌Newman的生長(zhǎng)曲線,研究該中藥有無(wú)抑菌或殺菌活性;并通過(guò)蛋白免疫印跡研究該中藥能否影響vWbp蛋白的表達(dá)水平;利用金葡菌試管凝血實(shí)驗(yàn)以及瓊脂糖平板實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步研究該中藥對(duì)vWbp蛋白活性的影響;4.通過(guò)DARTS(Drug Affinity Responsive Target Stability)實(shí)驗(yàn)和Thermal Shift Assay實(shí)驗(yàn)研究綿馬貫眾素與vWbp之間能否直接相互作用;5.通過(guò)構(gòu)建金葡菌體外導(dǎo)管感染模型和體內(nèi)金葡菌感染小鼠腎膿腫模型,研究綿馬貫眾素對(duì)金葡菌感染的實(shí)際治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.重組載體vWbp-p ET15b雙酶切后,在1527 bp處和5700 bp左右處各出現(xiàn)一條帶;SDS-PAGE結(jié)果顯示誘導(dǎo)后較誘導(dǎo)前在66 k Da處出現(xiàn)一條差異明顯的條帶,經(jīng)Ni柱親和層析后在66 k Da處出現(xiàn)單一條帶。2.金葡菌試管凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:vWbp的陽(yáng)性對(duì)照組10 min內(nèi)就已完全凝固,綿馬貫眾素加藥組能夠明顯延長(zhǎng)凝血時(shí)間,直至4 h才凝固。3.綿馬貫眾素作用下金葡菌的生長(zhǎng)曲線與野生菌株無(wú)明顯差異;Western blot結(jié)果顯示:隨著綿馬貫眾素濃度升高,vWbp蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。4.DARTS結(jié)果表明:隨著綿馬貫眾素濃度的增加,SDS-PAGE上殘留vWbp蛋白量隨之增加,Protase E對(duì)vWbp的消化作用則降低。反之,沒(méi)有加藥組,vWbp蛋白則被消化完全。5.Thermal Shift Assay結(jié)果顯示:綿馬貫眾素作用下,vWbp的Tm值與沒(méi)有加藥組相比,升高11℃,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2℃(差異2℃即認(rèn)為小分子與蛋白具有較強(qiáng)相互作作用)。6.金葡菌體外導(dǎo)管感染模型的掃描電鏡結(jié)果顯示:綿馬貫眾素作用下,粘附到導(dǎo)管表面的金葡菌大幅度降低,形成的纖維蛋白類(lèi)的生物基質(zhì)也明顯減少。7.金葡菌感染小鼠腎膿腫模型的病理學(xué)研究顯示:野生金葡菌組可看到有明顯膿腫形成;而vWbp敲低組(△vWbp),腎膿腫大幅度減少,幾乎沒(méi)有膿腫形成;綿馬貫眾素作用組與△vWbp組作用效果相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1.綿馬貫眾素512μg/m L不抑制金葡菌的生長(zhǎng),且不影響vWbp蛋白表達(dá)。2.綿馬貫眾素對(duì)vWbp的凝血活性有明顯抑制作用,存在劑量依賴(lài)性。3.綿馬貫眾素可直接與vWbp相結(jié)合,影響其活性及熱穩(wěn)定性。4.綿馬貫眾素可降低金葡菌在導(dǎo)管表面的粘附和纖維蛋白類(lèi)生物基質(zhì)的形成。5.綿馬貫眾素對(duì)金葡菌感染小鼠腎膿腫模型有治療作用。6.綿馬貫眾素可通過(guò)抑制vWbp活性,降低金葡菌毒力。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2807139