【摘要】：目的本研究針對(duì)復(fù)雜性疾病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA),選擇臨床治療痹證的經(jīng)典名方白虎加桂枝湯(Baihu-Guizhi decoction,BHGZD作為研究對(duì)象,開展全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的整合研究,按照“BHGZD化學(xué)成分庫(kù)的建立→候選靶標(biāo)預(yù)測(cè)→“疾病基因-藥物候選靶標(biāo)”相互作用網(wǎng)絡(luò)的建立和分析→BHGZD干預(yù)RA的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)篩選及作用機(jī)制挖掘→實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證”的研究路線,從“炎癥-免疫”網(wǎng)絡(luò)角度切入,初步鑒定該方的物質(zhì)基礎(chǔ),揭示該方干預(yù)RA的作用機(jī)制并篩選其關(guān)鍵靶標(biāo)。方法1.佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant-Induced Arthritis,AIA)動(dòng)物模型的構(gòu)建及BHGZD干預(yù)RA的藥效學(xué)評(píng)價(jià)1.1 AIA動(dòng)物模型的建立選用健康6～7周齡(體重200±20g)的雄性Lewis大鼠,每只大鼠尾根單次皮內(nèi)注射0.1mL完全弗氏佐劑,建立AIA大鼠模型。1.2動(dòng)物分組、給藥及取材雄性Lewis大鼠54只,隨機(jī)分為6組,分別為正常對(duì)照(Con)組(n=9)、AIA模型組(n=9)、低、中、高BHGZD干預(yù)組和甲氨蝶呤(MTX)干預(yù)組(n=6/組)。BHGZD三個(gè)給藥劑量為5.4、10.7、21.4g·kg-1,分別相當(dāng)于0.5、1、2倍臨床等效劑量;甲氨喋呤給藥劑量為0.2mg·kg-1,相當(dāng)于臨床等效劑量。大鼠給藥容積按照1mL/100g體重灌胃,從免疫當(dāng)天開始給藥,BHGZD干預(yù)組每給藥6天,間歇1天;甲氨蝶呤每給藥3天,間歇1天;Con組和AIA模型組灌服等體積蒸餾水,各組動(dòng)物給藥至造模第25天。第26天處死動(dòng)物,取關(guān)節(jié)、肝腎、滑膜等組織按操作要求進(jìn)行處置。1.3關(guān)節(jié)炎評(píng)價(jià)對(duì)AIA大鼠關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度、疼痛閾值、關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)價(jià),明確該方對(duì)RA的干預(yù)效果。采用蘇木素-伊紅(HE)染色法分別對(duì)AIA大鼠肝臟組織和腎臟組織進(jìn)行染色,鏡下觀察各組大鼠肝、腎受損情況,并計(jì)算肝、腎指數(shù)。2.全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的整合研究2.1全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)及差異表達(dá)基因篩選采用Agilent表達(dá)譜芯片配套試劑盒(Low Input Quick Amp Labeling Kit)提取大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織的RNA樣本,并用RNeasy mini kit純化標(biāo)記后的cRNA。采用全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)技術(shù)(Agilent Whole Rat Genome Microarray 4×44K),利用R軟件中Limma包對(duì)芯片檢測(cè)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化,計(jì)算基因組間表達(dá)量差異倍數(shù)(Fold-change)及T檢驗(yàn)(Student's t-test),以Fold Change≤0.5或Fold Change≥2,T-test P-value0.05為標(biāo)準(zhǔn),篩選AIA模型組與Con組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織之間的差異表達(dá)基因,獲得AIA病相關(guān)基因集。。2.2 BHGZD化學(xué)成分庫(kù)的建立用超高速液相色譜譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(ultra-fast liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry,UFLC-Q-TOF-MS/MS),對(duì)BHGZD 水液中化學(xué)成分進(jìn)行鑒定;從臺(tái)灣中醫(yī)藥資料庫(kù)TCM Data base@Taiwan獲取BHGZD五中藥的化學(xué)成分信息。2.3 BHGZD所含化學(xué)成分的候選靶標(biāo)預(yù)測(cè)于課題組前期建立的方法,預(yù)測(cè)BHGZDD含化學(xué)成分的候選靶標(biāo)。2.4 RA相關(guān)分子-BHGZD候選靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析合相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)收集的RA相關(guān)分子信息及AIA發(fā)病相關(guān)基因,基于BHGZD所含中藥及其相應(yīng)候選靶標(biāo)分子的相互作用,建立“RA相關(guān)分子-BHGZD候選靶標(biāo)”相互作網(wǎng)絡(luò)。算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦?節(jié)點(diǎn)連接度、節(jié)點(diǎn)介度和節(jié)點(diǎn)緊密度);篩選連接度大于所有節(jié)點(diǎn)連接度中位值兩倍的節(jié)點(diǎn),為網(wǎng)絡(luò)中的hub節(jié)點(diǎn),并進(jìn)行直接相互作用絡(luò)的構(gòu)建;選取上述拓?fù)涮卣髦稻笥谙鄳?yīng)中位值的節(jié)點(diǎn),為網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵hub節(jié)點(diǎn)。得上述關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)hub節(jié)點(diǎn)所參與的通路信息,通過統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算和通路富集分析,選與RA相關(guān)的通路。。3.BHGZD對(duì)預(yù)測(cè)信號(hào)軸的調(diào)控作用驗(yàn)證用蛋白印跡反應(yīng)(western blot,WB)檢測(cè)TLR4-c-Fos-IL2--TNF-α信號(hào)軸中TLR4(Toll-樣受體 4,Toll-like receptor 4)、c-Fos/APP1(原癌基因,Fos proto-oncogene/AP-1 transcription factor subunit)、IL2(白介素2,,interleukin 2)和TNF-α(腫瘤壞死因子-α,tumor necrosis factor-alpha)在AIA大鼠受累踝關(guān)節(jié)組織中的表達(dá)情況,并利用軟件進(jìn)行據(jù)分析。結(jié)果1.RA動(dòng)物模型的成功建立及BHGZD干預(yù)RA的藥效學(xué)評(píng)價(jià)AIA模型組大鼠紅腫、畸形癥狀顯著,即建模成功。BHGZD可有效緩解AIA大鼠關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度、緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變,并在一定劑量范圍內(nèi)(5.4g·kg-1～21.4g·kg-1)呈現(xiàn)劑量依賴性(p0.05、p0.01或p0.001)。AIA大鼠肝、腎組織HE染色結(jié)果,尚未觀察到AIA大鼠模型建立及BHGZD給藥造成的肝、腎損傷等病理變化。2.BHGZD干預(yù)RA相關(guān)“炎癥-免疫”失衡網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)制預(yù)測(cè)2.1 RA發(fā)病相關(guān)基因集的篩選基于全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)技術(shù),得到26個(gè)AIA模型組與Con組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織之間的差異表達(dá)基因,其中9個(gè)上調(diào)基因,17個(gè)下調(diào)基因。2.2 RA疾病相關(guān)基因的收集和整理從Drugbank和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)共收集到208個(gè)已知RA相關(guān)基因,與全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)所得26個(gè)AIA發(fā)病相關(guān)分子,去冗余后共得234個(gè)RA相關(guān)基因。2.3 BHGZD所含化學(xué)成分庫(kù)的建立采用UFLC-Q-TOF-MS/MS分析技術(shù),基于化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品、色譜行為、離子碎片以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)(Natural Products HR-MS/MS Spectral Library)信息共鑒定出41種化合物,其中19種化學(xué)成分是依據(jù)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)鑒定;從臺(tái)灣中醫(yī)藥資料庫(kù)TCM Database@Taiwan收集得到的123個(gè)BHGZD所含化學(xué)成分的二級(jí)結(jié)構(gòu)。2.4 BHGZD所含化學(xué)成分的候選靶標(biāo)基于BHGZD化學(xué)成分庫(kù),通過結(jié)構(gòu)相似性和功能相似性原理,預(yù)測(cè)得到1312個(gè)候選靶標(biāo),來自桂枝、甘草、知母、石膏、粳米的預(yù)測(cè)靶標(biāo)數(shù)目分別為545、701、197、424、266。其中含有53個(gè)已知干預(yù)RA的相關(guān)基因等。2.5 RA相關(guān)分子-BHGZD候選靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析基于BHGZD所含中藥與其對(duì)應(yīng)候選靶標(biāo)的相互作用,建立“RA相關(guān)分子-BHGZD候選靶標(biāo)”相互作用網(wǎng)絡(luò)。基于String數(shù)據(jù)庫(kù),提取上述RA相關(guān)分子和BHGZD候選靶標(biāo)的相互作用信息,并用string interaction score的中位數(shù)0.65為卡值,選取大于此卡值的相互作用信息;計(jì)算得到623個(gè)具有高連接度的hub節(jié)點(diǎn),計(jì)算節(jié)點(diǎn)連接度、節(jié)點(diǎn)介度和節(jié)點(diǎn)緊密度,獲得177個(gè)關(guān)鍵hub節(jié)點(diǎn)。在上述關(guān)鍵hub節(jié)點(diǎn)中,有39個(gè)是已知干預(yù)RA的相關(guān)基因,其中19個(gè)同時(shí)為BHGZD的候選靶標(biāo),如AGT、CCL5、CD40、CSF2、ESRI1、FOS、IFNG、IKBKB、IL110、IL1B、IL2、IL4、IL6、PPARG、PTGS2、PTK2B、TGFB11、TLR4和TNF。獲得上述關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)所參與的通路信息,通過統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算和通路富集分析,發(fā)現(xiàn)BHGZD干預(yù)RA的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)顯著參與Toll樣受體信號(hào)通路、B細(xì)胞及T細(xì)胞受體信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路等RA“炎癥-免疫”失衡相關(guān)通路,還顯著富集于三條與肪酸代謝相關(guān)的通路,脂肪酸合成通路、碳水化合物消化吸收以及脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路。其中TLR4、c-Fos、IL2與TN F-α四個(gè)分子顯著富集于Toll樣受體信號(hào)通路和T細(xì)胞受體信號(hào)通路,且具有直接相互作用關(guān)系。3.BHGZD可抑制RA“炎癥-免疫”失衡網(wǎng)絡(luò)TLR4-c-Fos-IL2-TNF-α信號(hào)軸相關(guān)蛋白的異常高表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Con組相比,AIA模型組的大鼠受累踝關(guān)節(jié)組織中TLR4、c-Fos、IL2及TNF-α四種蛋白的表達(dá)均異常升高(均p0.001),低、中、高劑量BHGZD均可下調(diào)此四種蛋白表達(dá)水平(p0.05、p0.01或p0.001)。結(jié)論1本研究基于AIA大鼠模型,發(fā)現(xiàn)BHGZD可顯著改善AIA大鼠關(guān)節(jié)紅腫、畸變、疼痛等癥狀,明確BHGZD對(duì)RA的干預(yù)效果。2通過開展全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的整合研究,篩選出顯著參與RA“炎癥-免疫”失衡網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的BHGZD的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo),其中包括TLR4、c-Fos、IL2及TNF-α等顯著富集于Toll樣受體信號(hào)通路和T細(xì)胞受體信號(hào)通路的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)。3通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明,BHGZD可能是通過調(diào)控“炎癥-免疫”失衡網(wǎng)絡(luò)TLR4-c-Fos-IL2-TNF-α信號(hào)軸發(fā)揮干預(yù)RA的藥效作用。4該方的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)還顯著富集于三條與肪酸代謝相關(guān)的通路,這可能與該方的寒藥性有關(guān)。綜上,本研究從“炎癥-免疫”網(wǎng)絡(luò)角度切入,初步揭示BHGZD干預(yù)RA的作用機(jī)制,為深入闡明該方治痹的科學(xué)內(nèi)涵提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為后續(xù)“病-證-方”結(jié)合研究奠定良好基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

ｏｎ邋；逡逑ｉ逡逑！逡逑；逡逑ｉ逡逑Ｉ逡逑；逡逑＼逡逑；逡逑．逡逑？逡逑ｓｉｓ邋；逡逑！逡逑！逡逑｜逡逑＼逡逑！逡逑１逡逑ｉｏｎ邋；逡逑；逡逑！逡逑！逡逑ｊ逡逑ｉ逡逑：逡逑

ＡＩＡ＋ＢＨＧＺＤ邋１０．７邋ｇ？ｋｇ－＇邐ＡＩＡ＋ＢＨＧＺＤ邋２１．４邋ｇ．ｋｇ．１邐ＡＩＡ＋ＭＴＸ邋０．２邋ｍｇ．ｋｇ．１邐＇邋１逡逑圖２．１．１白虎加桂枝湯對(duì)ＡＩＡ大鼠關(guān)節(jié)的影響逡逑３．２邋ＢＨＧＺＤ千預(yù)后可顯著改善ＡＩＡ大鼠關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重情況逡逑３．２．１邋ＢＨＧＺＤ可顯著緩解ＡＩＡ大鼠關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度逡逑（１）疾病嚴(yán)重程度量化評(píng)價(jià)指標(biāo)逡逑關(guān)節(jié)炎臨床積分、疾病發(fā)病率、首次發(fā)病時(shí)間及受累肢體累計(jì)率是最為直觀地反映逡逑疾病嚴(yán)重程度的量化評(píng)價(jià)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，低、中、高不同劑量ＢＨＧＺＤ干預(yù)后呈逡逑劑量依賴性改善ＡＩＡ大鼠關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度（圖２．１．２），表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎臨床積分、關(guān)節(jié)逡逑炎發(fā)病率及受累肢體累計(jì)率的下降，首次發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)。數(shù)據(jù)表明，ＡＩＡ模型組的關(guān)逡逑節(jié)臨床積分最高為３４分，發(fā)病率為９４％，首次發(fā)病時(shí)間為第１１天，受累肢體累計(jì)率為逡逑７３％邋（附錄表１－４）。逡逑

圖２．１．２白虎加桂枝湯對(duì)ＡＩＡ大鼠關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的影響逡逑（Ａ）各組大鼠關(guān)節(jié)臨床積分：（Ｂ）各組大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病率；（Ｃ）各組大鼠關(guān)節(jié)炎首次發(fā)病時(shí)間；（Ｄ）各組大鼠受逡逑累肢體累計(jì)率（數(shù)據(jù)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差農(nóng)示與正常對(duì)照組相比，ｐ＜０．０１，＿？＜０．００丨：“＊”，“＊＊”，“＊＊＊”及逡逑示與邋ＡＩＡ邋模型組相比，／７＜０．０５，ｐ＜０．０１，ｐ＜０．００１邋）逡逑①關(guān)節(jié)臨床積分：ＡＩＡ模型組大鼠的關(guān)節(jié)臨床積分為３４，低、中、高劑量ＢＨＧＺＤ干預(yù)逡逑后均可顯著降低關(guān)節(jié)臨床積分（＾＜０．０５、產(chǎn)０．０１或ｐ＜０．００１），其中高劑量ＢＨＧＺＤ的效逡逑果最為顯著（圖２．１．２八，／？＜０．００１）；逡逑②關(guān)節(jié)炎發(fā)病率：ＡＩＡ模型組大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病率高達(dá)９４％，中、高劑量ＢＨＧＺＤ干預(yù)后逡逑關(guān)節(jié)炎發(fā)病率均顯著降低（均ｐ＜0．0５），分別為７８％、６７％，低劑量ＢＨＧＺＤ療效稍差逡逑（圖邋２．１．２Ｂ）；逡逑③首次發(fā)病時(shí)間：ＡＩＡ模型組大鼠關(guān)節(jié)炎首次發(fā)病時(shí)間為造模第１１天，低、中、高劑逡逑量ＢＨＧＺＤ干預(yù)后可延長(zhǎng)關(guān)節(jié)炎首次發(fā)病時(shí)間（ｐ＜０．０５或／７＜０．００１），至造模第１２天，逡逑其中高劑量藥效最佳，效果與陽(yáng)性藥ＭＴＸ相似（圖２．１．２Ｃ）；逡逑④受累肢體累計(jì)率：ＡＩＡ模型組大鼠的受累肢體累計(jì)率為７３％，低、中、高劑量ＢＨＧＺＤ逡逑

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本文編號(hào)：2801651