發(fā)布時間：2020-08-21 23:06

【摘要】：目的1.建立穩(wěn)定的高膽紅素HepaRG細胞模型;2.通過高膽紅素HepaRG細胞模驗證茵梔黃“退黃”藥效并探究其機制;3.從茵梔黃已報道的化學成分中初步篩選茵梔黃“退黃”的潛在藥效物質(zhì)。方法1.通過膽紅素及丙磺舒共同干預HepaRG細胞建立高膽紅素細胞模型,以細胞內(nèi)總膽紅素(TBIL)和間接膽紅素(IBIL)含量評價細胞模型;2.采用茵梔黃提取物干預高膽紅素細胞,以細胞內(nèi)總膽紅素和間接膽紅素及細胞外直接膽紅素(DBIL)含量為指標評價茵梔黃“退黃”作用;采用RT-q PCR和Western-blot技術考察茵梔黃干預后細胞膜轉(zhuǎn)運體、代謝酶及核受體表達變化,探究茵梔黃“退黃”的分子機制。3.采用茵梔黃干預鹽酸苯肼誘導的高膽紅素大鼠,制備茵梔黃含藥血清,并用含藥血清干預高膽紅素HepaRG細胞;采用HPLC-MS/MS對茵梔黃提取物、含藥血清及細胞攝取物進行分析,篩選出茵梔黃“退黃”的潛在藥效物質(zhì)。結果1.高膽紅素細胞模型的建立:高膽紅素模型以40μg/mL膽紅素和50μg/mL丙磺舒共同干預HepaRG細胞12 h后,細胞內(nèi)總膽紅素及間接膽紅素含量最高,且更換含50μg/mL丙磺舒的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)可使細胞內(nèi)高膽紅素狀態(tài)維持在48h內(nèi)穩(wěn)定。2.茵梔黃退黃作用及其分子機制研究:720μg/mL茵梔黃提取物(茵陳:18%,梔子:10%,黃芩:60%,金銀花:12%)干預高膽紅素HepaRG細胞24 h后,茵梔黃組細胞內(nèi)總膽紅素和間接膽紅素含量與模型組相比顯著下降(P0.01),且細胞外直接膽紅素含量顯著升高(P0.01),其作用與陽性對照藥苯巴比妥相似(P0.05);而RT-q PCR和western-blot結果顯示,與模型組相比,茵梔黃組細胞膜轉(zhuǎn)運體多藥耐藥轉(zhuǎn)運蛋白2(MRP2)、代謝酶UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)及核受體組成型雄烷受體(CAR)的m RNA和蛋白表達均顯著升高(P0.05)。3.茵梔黃退黃藥效物質(zhì)的初步篩選:茵梔黃干預高膽紅素大鼠7 d后,其血清總膽紅素、直接膽紅素及間接膽紅素含量與模型對照組相比均顯著降低(P0.05),且大鼠含藥血清中測得茵梔黃已報道31種化合物中的10種;而含藥血清干預高膽紅素細胞后,細胞內(nèi)測得源于茵梔黃的化合物7種,分別是漢黃芩素、D-焦谷氨酸、異嗪皮啶(6,8-Dimethoxy-7-hydroxycoumarin)、京尼平龍膽雙糖苷、Safflor yellow A及2種結構未確定化合物。結論1.本研究通過膽紅素及丙磺舒干預HepaRG細胞,建立了穩(wěn)定的高膽紅素細胞模型;2.茵梔黃提取物可降低高膽紅素HepaRG細胞內(nèi)TBIL及IBIL含量,具有顯著的退黃作用,其藥效與陽性對照藥苯巴比妥無差異;而其退黃作用可能與茵梔黃上調(diào)核受體CAR的表達而使膽紅素代謝酶UGT1A1及外排轉(zhuǎn)運體MRP2的m RNA及蛋白表達增加有關。3.本研究通過細胞攝取含藥血清獲得的7種化合物,這7種化合物可能為茵梔黃退黃的潛在藥效物質(zhì)。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

大學碩士學位論文 茵梔黃方“退黃”分子機制及藥效物質(zhì)篩選初探、外界因素如毒素、化學物質(zhì)等，都會引起黃疸。近年來，分子生物學技術的發(fā)展促進了人們對黃疸分子機制的研究，從分子上探究膽紅素在體內(nèi)的代謝、調(diào)節(jié)等過程，進一步明確了黃疸發(fā)病的分子機紅素的代謝膽紅素是臨床診斷黃疸的重要指標，其代謝的場所主要在肝臟[1]，主要包括胞對血液中非結合膽紅素（又稱間接膽紅素，unconjugated bilirubin，UCB）取、非結合膽紅素在肝細胞中的運輸、非結合膽紅素向結合膽紅素（又稱直紅素，conjugated bilirubin，CB）的轉(zhuǎn)化以及結合膽紅素通過膽汁的外排 互關聯(lián)的生理過程[10, 11]（見圖 1-1）。在這些過程中，有多種酶、轉(zhuǎn)運體及調(diào)子參與，而參與膽紅素生物轉(zhuǎn)化的這些因子出現(xiàn)表達或功能障礙，可能會導紅素代謝的異常，引起黃疸等相關疾�。ㄒ姳� 1-1）。

學位論文 茵梔黃方“退黃”分子機制及藥效果細胞毒性考察TT 比色法考察膽紅素對 HepaRG 細胞的毒性，初步選定的膽紅素干預濃度。為了排除膽紅素溶劑 DMSO 對結果 DMSO 的培養(yǎng)基（DMSO : 培養(yǎng)基 = 1 : 20）干預細胞，性，不會影響膽紅素的細胞毒性實驗。、25、50、100、200、400 μg/mL 膽紅素干預 HepaRG 細結果顯示，膽紅素在干預 24 h 時，25、50 及 100 μg/mL ，而 200 及 400 μg/mL 則有抑制作用。但干預 48 h 后，除 2度的細胞死亡率明顯升高，在 100 μg/mL 時細胞死亡率約胞死亡率約為 40%（圖 2-1）。因此，本文欲在 0-100 μg/mepaRG 細胞 24 h 篩選高膽紅素細胞造模劑量。

膽紅素干預HepaRG細胞24 h篩選高膽紅素細胞造模劑量，通過測定細胞內(nèi)TBIL和 IBIL 濃度對模型進行評價。結果如圖2-2所示，細胞內(nèi)的TBIL濃度隨膽紅素的干預濃度的增加而增加，而當膽紅素干預濃度達到 40 μg/mL 時，細胞內(nèi) TBIL 濃度不再隨膽紅素干預濃度發(fā)生變化， IBIL 變化與 TBIL 相似，說明膽紅素干預濃度為 40 μg/mL 時，細

【參考文獻】

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1 黃艷芳;黎春杏;周志鵬;商淵婷;黃鎖義;;茉莉花莖化學成分的預試驗[J];時珍國醫(yī)國藥;2014年07期

2 張國強;周燕;魏玉輝;朱琳;武新安;;茵梔黃顆粒對膽管結扎大鼠肝細胞膜轉(zhuǎn)運體Mrp2、Ntcp及Bsep表達的影響[J];中成藥;2012年09期

3 茵梔黃口服液臨床研究協(xié)作組;馬曉路;施麗萍;陳理華;陳湘湘;杜立中;余加林;華子瑜;鐘丹妮;劉蕓芝;劉義;韋露明;黃韋芳;王俊平;陳運彬;楊杰;白文靜;潘新年;韋秋芬;崔其亮;吳惠晴;陳麗萍;譚小華;李于凡;李貴南;嚴超英;劉英;劉鳳敏;劉海櫻;闞清;封云;程銳;周曉玉;韓樹萍;余章斌;董小s

本文編號：2799959