【摘要】：目的:探討白頭翁湯正丁醇提取物對白念珠菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和液泡的作用及機(jī)制。方法:首先采用微量液基稀釋法檢測白頭翁湯正丁醇提取物(Butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction,BAEB)對白念珠菌的MIC_(80)和SMIC_(80)。針對白念珠菌細(xì)胞膜,通過spot assay觀察BAEB對白念珠菌細(xì)胞活性的影響;通過酶標(biāo)儀檢測白念珠菌細(xì)胞內(nèi)甘油含量以反映白念珠菌細(xì)胞內(nèi)滲透壓的變化;qRT-PCR定量檢測白念珠菌細(xì)胞內(nèi)滲透壓相關(guān)基因的表達(dá);通過熒光顯微鏡觀察BAEB對白念珠菌細(xì)胞膜通透性的影響;通過高效液相測定白念珠菌細(xì)胞膜中麥角甾醇的含量;qRT-PCR定量檢測白念珠菌細(xì)胞膜麥角甾醇合成相關(guān)基因的表達(dá)。針對白念珠菌細(xì)胞壁,Spot assay檢測BAEB、熒光白(Calcofluor white,CFW)、剛果紅(Congo red,CR)對白念珠菌細(xì)胞活性的影響;流式細(xì)胞儀和酶標(biāo)儀檢測BAEB對白念珠菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖的影響;流式細(xì)胞儀檢測BAEB對白念珠菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的影響;qRT-PCR檢測白念珠菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖合成相關(guān)基因及幾丁質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá);透射電鏡觀察白念珠菌細(xì)胞壁。針對白念珠菌液泡,通過熒光顯微鏡觀察BAEB對白念珠菌液泡膜的影響;qRT-PCR定量檢測BAEB對白念珠菌液泡合成相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果:256、512、1024μg/mL BAEB干預(yù)下白念珠菌的菌落數(shù)逐漸減少,活性逐漸降低;512、1024μg/mL BAEB組白念珠菌胞內(nèi)甘油含量分別為444.64±0.9nmol/mg、571.93±4.3 nmol/mg,和空白對照組相比甘油含量顯著性增多(P0.05),256、512、1024μg/mL BAEB組白念珠菌細(xì)胞內(nèi)滲透壓的相關(guān)基因HOG1分別下調(diào)了9.1倍、9.3倍、5.5倍;512、1024μg/mL BAEB組白念珠菌產(chǎn)生紅色熒光的細(xì)胞顯著增多;1024μg/mL BAEB干預(yù)后麥角甾醇峰面積為35.88495,與空白對照組對比有顯著性差異(P0.05);1024μg/mL BAEB干預(yù)組白念珠菌細(xì)胞膜麥角甾醇合成相關(guān)基因ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6、ERG10、ERG11、ERG13、ERG24、ERG25、ERG251、ERG26與UPC2分別下調(diào)了6.57、4.88、4.14、9.23、3.40、9.83、3.07、7.49、5.52、5.89、2.44、3.24、1.97、10.06倍。剛果紅、熒光白和BAEB組分別與白念珠菌空白對照組相比,活性均降低;256、512、1024μg/mL BAEB組白念珠菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖與幾丁質(zhì)暴露逐漸增多(P0.05);1024μg/mL BAEB干預(yù)組FKS1、CHS1、CHS2、CHS3、CHS8等β-1,3-葡聚糖與幾丁質(zhì)合成相關(guān)基因分別下調(diào)5.57、2.96、3.29、4.47、3.00倍;透射電鏡觀察BAEB干預(yù)后白念珠菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)有破損且電子密度小,細(xì)胞壁溶解。通過酵母液泡膜染料MDY-64染色,隨著BAEB濃度的增高白念珠菌液泡膜產(chǎn)生的綠色熒光顯著減少,呈劑量依賴的特征,液泡膜破損;1024μg/mL BAEB干預(yù)組APM1、CLA4、PEP7、PEP12、PKH2、VPS15、VPS34、VPS41、YPT72等液泡合成相關(guān)基因分別下調(diào)4.410、4.534、4.070、2.184、4.506、11.435、11.316、3.192、2.372倍。結(jié)論:以上結(jié)果表明BAEB可能通過使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破損,細(xì)胞膜關(guān)鍵組分含量減少,進(jìn)而破壞白念珠菌細(xì)胞膜的完整性從而抑制白念珠菌細(xì)胞的活性,同時可以抑制白念珠菌細(xì)胞膜麥角甾醇合成相關(guān)基因的表達(dá),減少麥角甾醇的合成。BAEB可使白念珠菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖及幾丁質(zhì)暴露從而破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)。同時可通過抑制β-1,3-葡聚糖、幾丁質(zhì)生物合成相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu),影響白念珠菌細(xì)胞壁完整性。BAEB可損傷白念珠菌液泡膜及下調(diào)白念珠菌液泡合成相關(guān)基因。本研究為研發(fā)新型抗真菌藥物及抗真菌機(jī)制的闡明提供實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

圖 1 .BAEB 對白念珠菌細(xì)胞活性的影響Fig 1. Effect of BAEB on activity of C.albicans3.3 BAEB 對白念珠菌細(xì)胞內(nèi)滲透壓及滲透壓相關(guān)基因的影響按照南京建成生物工程研究所甘油含量測定試劑盒說明書檢測胞量，空白對照組、256、512、1024 μg/mLBAEB 組和 FLZ 組吸光度分別0.193、0.194、0.18、0.173，依據(jù)甘油標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=0.0002x+0.066白對照組、256、512、1024 μg/mLBAEB 組和 FLZ 組胞內(nèi)甘油總量分別633.5、638.5、568.5、533.5 μmoL/L。按照碧云天蛋白檢測試劑盒方法蛋白總量，空白對照組、256、512、1024 μg/mLBAEB 組和 FLZ 組吸光1.923、1.832、1.759、1.686、1.747，依據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=0.16

2. BAEB 對白念珠菌細(xì)胞膜胞內(nèi)滲透壓的影響及滲透壓相關(guān)基因 HOG1 和 RHR2 的表達(dá)*.P<0.05；**.P<0.01）ig 2. Effect of BAEB on intracellular osmotic pressure of C.albicans and expression of osmoticressure-associated genes HOG1 and RHR2（*.P<0.05；**.P<0.01）.4 BAEB 對白念珠菌細(xì)胞膜通透性的影響通過熒光顯微鏡觀察，白念珠菌產(chǎn)生紅色熒光的強(qiáng)度隨著 BAEB 濃度的增加逐漸增強(qiáng)，空白對照組的白念珠菌產(chǎn)生紅色熒光最少且最弱，1024 μg/mL BAEB白念珠菌產(chǎn)生紅色熒光最多且最強(qiáng)。（如圖 3A1-E1）。菌株熒光圖相對應(yīng)的明

BAEB對白念珠菌細(xì)胞膜通透性的影響（400×）

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2796993