【摘要】：目的:采用藥理學,病理學,分子生物學,電鏡等多種科研技術(shù)與方法,以探討復方蛇龍膠囊降低大鼠腎性蛋白尿及對足細胞保護作用的機制。方法:以72只SPF級健康雄性大鼠為研究對象,隨機取12只作為正常對照組,其余60只應用兩次尾靜脈注射阿霉素(ADR)的方法建立腎性蛋白尿的動物模型,經(jīng)檢測尿蛋白定量大于100 mg/24h者模型復制成功,隨機分為模型組,陽性對照藥組(雷公藤組)、復方蛇龍膠囊低、中、高劑量組。各組分別予灌胃給藥,灌胃體積為2 ml/100g·d,雷公藤組以成人臨床用量的5倍,即5 mg/kg·d作為大鼠給藥劑量;低劑量組以成人臨床藥量的3.75倍(即相當于生藥0.375 g/kg·d)作為大鼠給藥劑量,中劑量組為成人臨床藥量7.5倍(相當于生藥0.75 g/kg·d)作為大鼠給藥劑量,高劑量組為成人臨床藥量15倍(相當于生藥1.5 g/kg·d)作為大鼠給藥劑量,正常組與模型組給予等體積的生理鹽水。分別檢測大鼠給藥0周、2周、4周、6周、8周的24小時尿蛋白排泄量;連續(xù)給藥4周,每組隨機抽取大鼠6只,測定血漿總蛋白、白蛋白、總膽固醇、甘油三酯等生化指標,同時對腎皮質(zhì)進行形態(tài)學觀察;各組剩余大鼠繼續(xù)給藥至8周,依上法檢測上述指標。以條件永生代小鼠腎足細胞MPC5為研究對象,利用CCK-8試劑盒的方法篩選ADR的造模劑量及復方蛇龍膠囊的試驗劑量。分別在干預完成后,檢測各組相關(guān)指標:利用RT-PCR和Western blot分別從基因和蛋白的水平檢測足細胞特異性蛋白nerphrin、podocin、synaptopodin及凋亡因子cyt-C、caspase9、caspase3;在蛋白層面檢測cAMP反應元件結(jié)合蛋白(CREB)的表達水平;利用雙抗體夾心法檢測cAMP的水平;利用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡;利用Jc-1試劑盒檢測線粒體膜電位的變化;利用比色法檢測ATP水平;利用透射電鏡對其進行形態(tài)學觀察。結(jié)果:1.復方蛇龍膠囊可顯著降低大鼠24 h蛋白尿排泄量,升高血漿總蛋白和白蛋白,降低總膽固醇和甘油三酯。同時,形態(tài)學觀察表明:光鏡下,正常組大鼠GBM結(jié)構(gòu)完整,基質(zhì)及系膜細胞未見增生。給藥組與模型組相比,足細胞輕微腫脹,基質(zhì)及系膜細胞可見輕度增生,腎小管管腔內(nèi)可見少量蛋白管型,間質(zhì)有輕微炎性細胞侵潤;電鏡下,空白組大鼠GBM完整平滑,無系膜細胞及基質(zhì)增生,足突排列整齊,無融合,給藥組優(yōu)于模型組,其基質(zhì)及系膜細胞增生較輕,僅見少量足突融合,腎小管細胞水腫較輕,線粒體腫脹變性程度較少,溶酶體減少。2.ADR造模劑量為0.25μg/ml,干預時間為24 h;確立復方蛇龍膠囊高中低劑量組,分別為100 ng/ml,75 ng/ml,50 ng/ml,干預時間為24 h。3.復方蛇龍膠囊可上調(diào)足細胞相關(guān)特異性因子nerphrin、podocin、synaptopodin基因水平及蛋白水平,抑制凋亡因子cyt-C、caspase9、caspase3基因水平及蛋白水平,抑制細胞凋亡,上調(diào)cAMP水平,減輕線粒體膜電位的下調(diào),提高ATP水平。形態(tài)學觀察表明:透射電鏡下,給藥組足細胞較模型組線粒體腫脹程度較輕,線粒體嵴排列紊亂程度較輕,溶酶體破裂程度較輕,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒程度減輕,核固縮程度較輕。結(jié)論:1.復方蛇龍膠囊可有效降低大鼠腎性蛋白尿的排泄量。2.復方蛇龍膠囊降低蛋白尿及對足細胞保護作用的機制可能是通過調(diào)節(jié)cAMP水平,調(diào)節(jié)下游蛋白CREB磷酸化,一方面維持足細胞特異性蛋白nerphrin、podocin、synaptopodin水平,另一方面維持線粒體結(jié)構(gòu)與功能,抑制細胞凋亡,抑制線粒體膜電位的降低,提高ATP的含量而達到保護足細胞的作用,繼而維護了濾過屏障的完整性,減輕蛋白漏出,從而達到降低蛋白尿的目的。
【學位授予單位】：山西省中醫(yī)藥研究院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2786675