發(fā)布時間：2020-08-06 10:05

【摘要】：目的:凝血酶是抗凝血的重要靶點,新型口服抗凝藥直接作用于凝血酶發(fā)揮抗凝作用。新型口服抗凝藥具有出血、缺乏特異對抗劑、漏服發(fā)生嚴重并發(fā)癥等嚴重不良反應(yīng)。丹參作為活血化瘀最常用的中藥,目前研究表明其成分具有較強的抗凝血作用,當(dāng)歸常與丹參配伍的用作活血抗凝,因此選擇丹參和當(dāng)歸作為超濾親和篩選對象。本文擬建立超濾親和凝血酶抑制劑篩選方法,快速高通量篩選中藥中抗凝血酶成分。對丹參、當(dāng)歸的成分進行凝血酶結(jié)合后的超濾篩選,并通過質(zhì)譜進行鑒定和抗凝血活性測定確定抗凝血酶活性成分。而后通過活性驗證及等溫滴定量熱技術(shù)對丹參和當(dāng)歸中抗凝血酶活性成分進行機制研究,以期確認其抗凝活性并探究其抗凝血酶機制。方法:1.建立基于超濾親和技術(shù)的抗凝血酶活性成分篩選方法,考察不同孵育時間及孵育溫度對方法的影響,并考察凝血酶的溶劑耐受性。2.通過UPLC法分離丹參、當(dāng)歸的醇提物和水提物,建立其指紋圖譜。3.通過UPLC-LTQ-Obitrap-MSn質(zhì)譜儀對丹參、當(dāng)歸成分進行鑒定,而后通過建立的超濾親和篩選方法對丹參、當(dāng)歸進行抗凝血酶活性成分篩選。4.通過生色底物法驗證篩選成分的抗凝血酶活性并通過等溫滴定量熱儀(ITC)測定潛在抗凝血酶活性成分與凝血酶的滴定曲線,分析熱力學(xué)參數(shù),并探討潛在活性成分的作用機制。結(jié)果:1.本文成功建立超濾親和抗凝血酶活性成分篩選方法,經(jīng)考察,確定孵育條件為37℃下孵育40min。滅活凝血酶對丹酚酸A無結(jié)合,證明凝血酶雖然與配體不存在非特異性結(jié)合,特異性的結(jié)合占主要地位。凝血酶具有較好的溶劑耐受性,在30%DMSO PBS溶液和60%甲醇中能保持50min穩(wěn)定的活性。2.建立了丹參水提物和醇提物及當(dāng)歸水提物和醇提物的UPLC分離方法,結(jié)果顯示所有分離良好,樣品溶液各色譜峰面積及保留時間均無顯著性差異,重復(fù)性良好。3.本文在丹參水提物、丹參醇提物、當(dāng)歸水提物、當(dāng)歸醇提物中分別篩選9、9、4、7個潛在抗凝血酶活性成分。結(jié)合標準品、reayxs數(shù)據(jù)庫、ETCM數(shù)據(jù)庫及相關(guān)參考文獻比對,指認了丹參水提物中26個成分,丹參醇提物中22個成分,當(dāng)歸水提物中24個成分、當(dāng)歸醇提物中45個成分,為超濾親和篩選后的成分確定提供基礎(chǔ),同時為丹參、當(dāng)歸的物質(zhì)研究提供的新的基礎(chǔ)。4.經(jīng)活性驗證實驗,確定了丹參素、β熊果苷、丹酚酸D、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ具有抗凝血酶活性,α熊果苷不具有抗凝血酶活性,確證了方法的可靠性。等溫滴定量熱法測定丹酚酸D與凝血酶的結(jié)合為離子鍵結(jié)合,揭示了凝血酶與潛在活性成分可能的作用方式。結(jié)論:本研究為從復(fù)雜的天然藥物中尋找抗凝血酶活性成分提供了可靠的篩選方法;為其他酶的抑制劑篩選提供了新的思路;為非水溶性化合物的超濾親和篩選方法提供了新思路;為小分子藥物與酶等生物大分子的相互作用研究提供了有效方法;同時對于丹參、當(dāng)歸抗凝血酶活性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了參考和依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R284
【圖文】：

血栓性疾病越來越成為誘發(fā)心腦血管系統(tǒng)的主要因素，嚴重威脅著人類生逡逑命健康。導(dǎo)致血栓形成的主要三個因素為：血管因素；血液理化性質(zhì)的改變；血液流變逡逑學(xué)的改變［１］。其中，凝血和抗凝血過程如圖１．１所示：逡逑內(nèi)源性凝血途徑邐外源性凝血途徑逡逑Ｉ邐古逡逑Ｘ邐？Ｘａ邋？邐Ｘ逡逑纖溶酶原逡逑ｎ邋%煎危懼澹齲徨危赍澹煎蝸巳苊岡せ釵镥義希岡駑澹福╁蝸巳苊稿義峽鼓肛必�，ＯX危掊義希懾�？e徨邋危澹牛模繡義希ㄏ宋鞍自ㄏ宋鞍祝ㄏ宋鞍捉到獠錚╁義賢跡保毖耗獺⒖鼓胂宋鞍姿夤�，实线为凝血过倡H⑿橄呶鼓體義夏甘欽瞿討械淖詈笠患�，地位十贩N匾�。灾J褐杏耄危幔岷銑蝕倌義希ǎ媯幔螅簦┕剮�，单秮礞哉C士鼓ǎ螅歟錚鰨┕剮�，通过碟X冢危幔吶ǘ齲詞迪摯鼓澳﹀義夏�。与Ｎａ＋结合的凝血酶，能够特覕棠结合纤维蛋熬Y停校粒沂芴澹偈瓜宋鞍自義銜宋鞍�。同时，能够特异芯壞切割ＰＡ＿b俳“寰奐�；引迄g淥蜃擁惱義戲蠢�，使凝血酶｀P杉絳福揮盞薊罨勸濱０訪敢蜃櫻兀桑桑傻韌肥迪執(zhí)馘義轄耗痰墓δ埽�。辶x夏傅慕岷銜壞閿校夯钚越岷銜壞悖ǎ幔悖簦椋觶邋澹螅椋簦澹

本文編號：2782221