【摘要】：卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤,由于早期很難發(fā)現(xiàn),患者因出現(xiàn)臨床癥狀而就診時(shí),往往腫瘤已對(duì)周圍組織器官造成侵襲,出現(xiàn)盆、腹腔內(nèi)的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。化療是卵巢癌的重要治療手段,卵巢癌的臨床化療方案以鉑類和紫杉醇為主導(dǎo),化療初始時(shí)約有80%的患者顯示治療有效,然而多數(shù)患者很快就會(huì)因腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)的出現(xiàn)而使治療效果受到嚴(yán)重影響。卵巢癌易于侵襲轉(zhuǎn)移和易于產(chǎn)生MDR的特點(diǎn),使其成為臨床上預(yù)后最差的婦科腫瘤,在充分治療的情況下,五年生存率仍低于45%,因此,研發(fā)、尋找更為有效的治療藥物,尤其是尋找在抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí),還能抑制腫瘤侵襲或逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的藥物,對(duì)卵巢癌的治療具有重大意義。本室參與研制的鹽酸千金藤堿(cepharanthine hydrochloride,CH),是經(jīng)由千金藤屬植物頭花千金藤中提取的千金藤素(cepharanthine,CEP)鹽化而得到的半合成化合物。多個(gè)研究證明,CEP在某些類型的腫瘤中可以表現(xiàn)出直接的抗腫瘤活性,也可以抑制某些腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,另外有研究證實(shí)CEP可以有效地增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,而CEP或CH對(duì)卵巢癌相關(guān)方面的作用在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。為了探索CH對(duì)卵巢癌的作用,我們選取上皮來(lái)源的卵巢癌耐紫杉醇且具有MDR表型的A2780/Taxol細(xì)胞株和其親本的A2780細(xì)胞株為模型,采用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究了CH對(duì)卵巢癌的增殖、凋亡、遷移和多藥耐藥性的影響及其作用機(jī)制,以求擴(kuò)大CH可能的臨床適應(yīng)證,為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。根據(jù)涉及內(nèi)容的相關(guān)性,本研究可以分成以下兩個(gè)部分:第一部分鹽酸千金藤堿對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機(jī)制的研究目的:本部分以卵巢癌A2780細(xì)胞為受試對(duì)象,旨在研究CH對(duì)A2780細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法:采用MTT法檢測(cè)不同濃度的CH作用于A2780細(xì)胞72 h的增殖抑制率,并求得IC_(50);采用MTT法檢測(cè)以IC_(50)濃度的CH作用于A2780細(xì)胞24 h、48 h、72 h和96 h的增殖抑制率;采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CH對(duì)A2780細(xì)胞凋亡的影響;采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CH對(duì)A2780細(xì)胞遷移能力的影響;采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CH對(duì)A2780細(xì)胞侵襲能力的影響;采用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CH對(duì)A2780細(xì)胞Bcl-2、MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果:1.CH對(duì)A2780細(xì)胞的增殖抑制,隨著濃度的增加(1.25、2.5、5、10、20、40和80μM)和作用時(shí)間的延長(zhǎng)(24、48、72和96 h),MTT結(jié)果顯示抑制率逐漸增大;CH作用于A2780細(xì)胞72 h的IC_(50)為30.21±1.24μM。2.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780細(xì)胞48 h后,流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,細(xì)胞晚期凋亡呈濃度依賴性增加(8.5±1.7%、12.0±1.0%、14.3±2.1%v.s.2.9±0.7%,p0.01)。3.CH以8μM的濃度作用于A2780細(xì)胞不同時(shí)間(24、48 h)后,劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低(3.8±2.5%v.s.33.3±5.7%,7.1±1.8%v.s.43.5±1.2%,p0.01)。4.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780細(xì)胞48 h后,Transwell檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,穿透基底膜進(jìn)入小室下層的細(xì)胞數(shù)呈濃度依賴性減少(79.6±3.6、68.2±3.1、68.2±3.1 v.s.101.4±4.9個(gè),p0.01),CH對(duì)A2780細(xì)胞的侵襲抑制率呈濃度依賴性增加(21.5±3.6%、32.7±3.1%、43.0±2.6%)。5.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780細(xì)胞48 h后,RT-qPCR檢測(cè)顯示,Bcl-2、MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)水平均呈濃度依賴性降低。小結(jié):本部分研究表明,CH能夠抑制卵巢癌A2780細(xì)胞的增殖,并且其抑制作用具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性;CH能夠濃度依賴性地促進(jìn)A2780細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡,而對(duì)早期凋亡無(wú)顯著影響,其機(jī)制可能和抑制凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因Bcl-2的表達(dá)相關(guān);CH能夠抑制A2780細(xì)胞的遷移和侵襲能力,其機(jī)制可能和抑制遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因MMP-2和MMP-9的表達(dá)相關(guān)。第二部分鹽酸千金藤堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)及其機(jī)制的研究目的:本部分以卵巢癌耐藥細(xì)胞A2780/Taxol和其親本的A2780細(xì)胞為受試對(duì)象,旨在研究CH對(duì)A2780/Taxol細(xì)胞MDR的逆轉(zhuǎn)作用及其相關(guān)機(jī)制。方法:采用MTT法檢測(cè)不同濃度的紫杉醇作用于A2780/Taxol細(xì)胞和A2780細(xì)胞72 h的增殖抑制率,求得IC_(50)同時(shí)計(jì)算耐藥倍數(shù);采用MTT法檢測(cè)梯度濃度的紫杉醇單獨(dú)及其與CH共同作用于A2780/Taxol細(xì)胞72 h的增殖抑制率,并計(jì)算IC_(50)和逆轉(zhuǎn)倍數(shù);采用羅丹明蓄積實(shí)驗(yàn),通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)并比較A2780/Taxol細(xì)胞和A2780細(xì)胞的羅丹明123(Rhodamine 123,Rho-123)的蓄積能力;采用羅丹明蓄積實(shí)驗(yàn),通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CH對(duì)A2780/Taxol細(xì)胞P-gp功能的影響;采用RT-qPCR法檢測(cè)CH對(duì)A2780/Taxol細(xì)胞MDR1 mRNA表達(dá)水平的影響;采用Western blot法檢測(cè)不同濃度CH對(duì)P-gp表達(dá)水平的影響;采用Western blot法檢測(cè)不同濃度CH對(duì)總Akt和磷酸化Akt表達(dá)的影響,考察CH對(duì)Akt磷酸化的調(diào)節(jié)作用;采用Western Blot法檢測(cè)CH單用及與PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002合用后A2780/Taxol細(xì)胞中P-gp表達(dá)的變化,考察CH對(duì)A2780/Taxol細(xì)胞PI3K/Akt通路的影響。結(jié)果:1.紫杉醇對(duì)卵巢癌耐藥株A2780/Taxol細(xì)胞和敏感株A2780細(xì)胞作用72 h的IC_(50)分別為1475.0±22.6和39.5±2.8 ng/ml;A2780/Taxol細(xì)胞的耐藥倍數(shù)為37.3。2.羅丹明蓄積實(shí)驗(yàn)顯示,A2780/Taxol細(xì)胞的Rho-123蓄積能力顯著高于A2780細(xì)胞(25.1±3.1%v.s.2.6±1.1%,p0.01)。3.RT-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示,A2780/Taxol細(xì)胞MDR1 mRNA的表達(dá)水平顯著高于A2780細(xì)胞。4.梯度濃度的紫杉醇單獨(dú)或者與不同濃度(2、4、8μM)的CH共同作用于A2780細(xì)胞72 h后,MTT法檢測(cè)顯示,與紫杉醇單用組相比,CH紫杉醇合用組IC_(50)呈濃度依賴性降低(688.0±7.9、478.3±9.6、185.7±6.5 v.s.1475.0±22.6 ng/ml,p0.01),CH的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)呈濃度依賴性增加(2.1、3.1、7.9)。5.CH以不同濃度(2、4、8μM)處理A2780/Taxol細(xì)胞2 h后,羅丹明蓄積實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示,與未處理組相比,CH處理組Rho-123的蓄積呈濃度依賴性升高(13.8±2.2%、17.5±1.0%、23.1±2.1%v.s.2.6±1.1%,p0.05)。6.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780/Taxol細(xì)胞48 h后,RT-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示,MDR1 mRNA的表達(dá)水平呈濃度依賴性降低。7.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780/Taxol細(xì)胞48 h后,Western blot實(shí)驗(yàn)顯示,P-gp的表達(dá)水平呈濃度依賴性降低,總Akt蛋白的表達(dá)不變,磷酸化Akt蛋白呈濃度依賴性降低。8.CH與PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002共同作用后,與CH單獨(dú)作用或LY294002單獨(dú)作用相比,P-gp表達(dá)的下調(diào)顯著加強(qiáng)。小結(jié):本部分研究表明,CH能夠濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥株A2780/Taxol細(xì)胞的MDR,使其對(duì)紫杉醇的敏感性大大增加;CH能夠濃度依賴性地抑制A2780/Taxol細(xì)胞的P-gp功能,使其藥物轉(zhuǎn)運(yùn)泵的作用大大下降;CH能夠濃度依賴性地抑制A2780/Taxol細(xì)胞MDR1 mRNA的表達(dá)、P-gp的表達(dá)和磷酸化Akt的表達(dá);CH逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的機(jī)制可能涉及對(duì)Akt磷酸化的抑制降低了PI3K/Akt信號(hào)通路的活性,從而抑制了P-gp的表達(dá)。全文結(jié)論1.CH能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,其機(jī)制可能和抑制凋亡和遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表達(dá)相關(guān)。2.CH通過(guò)抑制P-gp的表達(dá)和功能,逆轉(zhuǎn)卵巢癌的多藥耐藥。3.CH通過(guò)抑制Akt的磷酸化來(lái)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活性,從而達(dá)到其逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的卵巢癌耐藥的作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

分 鹽酸千金藤堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響及的生物學(xué)性質(zhì)，包括抗炎、抗病毒和抗過(guò)敏活性[30]各種藥理學(xué)作用而引起了研究人員額外的關(guān)注。研腹水瘤和膽管癌細(xì)胞的增殖，直接發(fā)揮其抗腫瘤活G-63 細(xì)胞的遷移和侵襲能力[33]；可以引發(fā)人肝癌細(xì)的凋亡。此外多項(xiàng)研究證實(shí)，CEP 可以有效地增強(qiáng)性，并抑制人膀胱癌細(xì)胞[35]，肝癌細(xì)胞[36]、膽管癌細(xì)胞[37]中的 P-gp 表達(dá)。EP 在腫瘤治療領(lǐng)域的光明前景，本實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合中科學(xué)生物醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)基地，以天然單體化合物 CEP 其水溶性和療效，研制出半合成化合物鹽酸千金藤堿de，CH），其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下圖所示。

表 1.1 MTT 法檢測(cè)不同濃度的 CH 對(duì)卵巢癌 A2780 細(xì)胞的抑制率le 1.1 The inhibition rate of A2780 treated with different concentration of CH bayConcentration of CH (μM) Inhibitory rate (%)80 96.36±1.3440 79.57±3.4020 49.16±2.5410 29.24±3.665 20.23±0.872.5 15.57±5.061.25 2.71±2.00IC5030.21±1.24 μM驗(yàn)數(shù)據(jù)用三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。ata were expressed as mean ± SD of triplicate experiments.

第一部分 鹽酸千金藤堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響及其作用機(jī)制Figure 1.1 The curve of the inhibiton of A2780 treated with CH for 72 h. were expressed as mean ± SD of triplicate experiments.為了考察 CH 對(duì) A2780 細(xì)胞的增殖抑制和作用時(shí)間的關(guān)系，根據(jù)上一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選取接近 CH 的 IC50濃度 30 μM，進(jìn)一步檢測(cè)加入 CH 后持作用不同時(shí)間（24、48、72 和 96h）對(duì) A2780 細(xì)胞的增殖抑制。結(jié)果如圖所示，不同組間對(duì) A2780 細(xì)胞的抑制率具有顯著性差異，并且隨著 CH 作用間的延長(zhǎng)，對(duì) A2780 細(xì)胞的抑制率逐步增大，表明 CH 對(duì) A2780 細(xì)胞的抑制用具有時(shí)間依賴性。

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本文編號(hào)：2781575