【摘要】：背景脊髓損傷(Spinal Cord Injury,SCI)是臨床常見疾患,致殘率高,遠(yuǎn)期缺乏有效治療的藥物。本課題基于多年珍寶丸臨床治療經(jīng)驗(yàn)及前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),含珍珠層,蟾蜍,麝香,羚羊的珍寶丸對脊髓損傷(SCI)有良好的治療作用。然而,其修復(fù)脊髓損傷的復(fù)雜機(jī)制尚不清楚,脊髓損傷中各種復(fù)雜的分子機(jī)制還不是十分明確,還需要進(jìn)一步的探討及研究,本文從珍寶丸入手,使用脊髓損傷的大鼠模型進(jìn)行研究,以期得到珍寶丸在脊髓損傷再生修復(fù)中的作用和相關(guān)機(jī)制。第一部分珍寶丸通過上調(diào)HSP27減少Treg細(xì)胞緩解大鼠脊髓損傷目的本研究旨在探討CD4 + CD25 + Foxp3 +調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在珍寶丸修復(fù)脊髓損傷作用機(jī)制中的作用,進(jìn)一步探討Tregs與HSP27在修復(fù)機(jī)制中的關(guān)系。方法用珍寶丸不同濃度(0,0.5,2.5,5,10mg/mL)處理人外周血單個核細(xì)胞(PBMCs),流式細(xì)胞儀檢測Tregs中特異性因子CD4 + CD25 + Foxp3 +的表達(dá),用ELISA測定檢測Tregs相關(guān)調(diào)節(jié)因子TGF-β含量。熒光素酶法檢測miR-214與HSP27的關(guān)系,qR-PCR法檢測miR-214的表達(dá)水平。qPCR和Western blotting檢測HSP27的表達(dá)。采用RNA干擾技術(shù)和基因重組技術(shù)抑制和上調(diào)HSP27的表達(dá)。結(jié)果珍寶丸對Tregs的IC50為11.61mg/mL,可顯著抑制人PBMCs分化成Tregs,并上調(diào)超過1倍的HSP27表達(dá)。基本上,它通過抑制miR-214表達(dá)(50%)來增強(qiáng)HSP27的表達(dá)。在人PBMCs中促進(jìn)了 HSP27表達(dá)的抑制,隨后分化成Tregs。當(dāng)HSP27表達(dá)上調(diào)時,向Tregs的分化減少30%。這表明HSP27的表達(dá)調(diào)節(jié)了向Tregs的分化。抑制HSP27表達(dá)和珍寶丸治療后,分化成Tregs的比例下降,但仍高于僅用藥治療組。在珍寶丸的作用下,HSP27的表達(dá)沒有完全干擾,其表達(dá)水平仍然增加。結(jié)論在脊髓損傷再生修復(fù)的過程中,珍寶丸通過誘導(dǎo)HSP27表達(dá)來抑制Treg細(xì)胞數(shù)量和降低TGF-β的水平。第二部分珍寶丸通過調(diào)節(jié)GPR17表達(dá)的miR-146a-5p防止急性脊髓損傷目的本研究旨在觀察珍寶丸對急性脊髓損傷(ASCI)大鼠運(yùn)動功能的影響,以及miR-146a-5p和G蛋白偶聯(lián)受體17(GPR17)的分子機(jī)制。方法用Allen's法建立急性脊髓損傷的大鼠模型,將大鼠分為3組。將SH-SY5Y細(xì)胞在低氧條件下培養(yǎng)過夜并用miR-146a-5p模擬物或miR-146a-5p抑制劑轉(zhuǎn)染。用(Basso,Beattie,Bresnahan,BBB)評分系統(tǒng)評估大鼠的后肢運(yùn)動功能。實(shí)時熒光定量 PCR(qRT-PCR)和 Western blot 檢測 miR-146a-5p,GPR17,誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS),白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)。使用低細(xì)胞計數(shù)測定法測量神經(jīng)元凋亡。進(jìn)行螢光素酶報告基因測定以確定miR-146a-5p 對 GPR17 的調(diào)節(jié)。結(jié)果珍寶丸可增加miR-146a-5p的表達(dá)水平,降低GPR17的表達(dá),生物信息學(xué)軟件預(yù)測GPR17 3'-UTR與miR-146a-5p具有結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,miR-146a-5p對GPR17表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。降低miR-146a-5p可逆轉(zhuǎn)珍寶丸對缺氧誘導(dǎo)的GPR17上調(diào)的作用,逆轉(zhuǎn)珍寶丸對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用及增強(qiáng)珍寶丸對ASCI大鼠后肢運(yùn)動功能的恢復(fù)。因此,珍寶丸能增強(qiáng)后肢運(yùn)動功能,減輕急性脊髓損傷引起的炎癥反應(yīng)。結(jié)論珍寶丸可通過調(diào)節(jié)miR-146a-5p/GPR17表達(dá)來抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

根據(jù)預(yù)先建立的模型描述協(xié)議［５６］建立了邋ＳＣＩ模型。ＳＣＩ組大水合三氯乙醛（３ｍＬ／ｋｇ）腹部注射麻醉，俯臥位固定，胸背部剃毛備消毒，定位于Ｔ１０棘突位置，以此為中心作為背部正中切口，切開暴脊椎，在Ｔ］０棘突處進(jìn)行２０ｓ脊椎擠壓至脊髓損傷，縫合傷口，術(shù)后肢癱瘓，表明建模成功（圖１Ａ－Ｆ）。正常組大鼠利用相同方法暴露脊

１．３分組逡逑治療ＳＣＩ大鼠隨機(jī)分為４組：對照組（ｎ＝１０）；珍寶丸０．２，邋０．４和０．８邋ｇ／ｋｇ逡逑組（ｎ＝１０），珍寶丸組大鼠口服珍寶丸（圖２），每日１次，每日一次，共６周；逡逑對照組（ｎ＝１０）大鼠口服用賦形劑（０．５％羧甲基纖維素鈉）給藥。逡逑圖２給藥過程逡逑１．４神經(jīng)評估逡逑每周使用珍寶丸治療，使用（ｔｈｅ邋Ｂａｓｓｏ，邋Ｂｅａｔｔｉｅ邋ａｎｄ邋Ｂｒｅｓｎａｈａｎ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ逡逑ｓｃａｌｅ，ＢＢＢ）運(yùn)動動能評分評估雙后肢運(yùn)動功能［５７］。如前所述［５８］，傳感器電機(jī)逡逑柵格步行測試旨在檢查大鼠精確控制后爪放置的功能。在ＢＢＢ測試中至少步態(tài)逡逑良好的大鼠不能進(jìn)行人行道，并根據(jù)最大值進(jìn)行分類。為了減少平均誤差和提高逡逑準(zhǔn)確性，所有的評估都采用雙盲技術(shù)進(jìn)行：兩個人從不同的側(cè)面觀察，并獨(dú)立記逡逑錄得分，然后獲得平均值。逡逑１．５細(xì)胞培養(yǎng)逡逑如前所述［５９］，從健康受試者的供體人血中制備人ＰＢＭＣ，并將分離的人逡逑ＰＢＭＣ儲存在氮罐中。我們從氮罐中取出人類ＰＢＭＣ，并在３７°Ｃ迅速融化不超逡逑過１分鐘。在無菌條件下

逡逑０．４或０．８邋ｇ邋／邋ｋｇ）處理組大鼠的腳步誤差顯著低于ＳＣＩ對照組（圖３Ｂ）。ＳＣＩ逡逑后大鼠Ｔｒｅｇｓ百分比明顯高于正常組。與ＳＣＩ對照組相比，Ｔｒｅｇｓ珍寶丸的百分逡逑比（０．２，邋０．４或０．８邋ｇ／ｋｇ）治療組均有不同程度的下降。珍寶丸劑量在０．２－０．８邋ｇ逡逑／ｋｇ范圍內(nèi)，Ｔｒｅｇｓ百分比與濃度呈負(fù)相關(guān)（圖３Ｃ）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑２０－ｎ邐８０－逡逑ＣＯ／７邐一逡逑？邐－＊？邋０．２＾邋ｇ邋％逡逑Ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｊｕｒｙ邐＾邐＾邐＾逡逑６邋ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋Ｚｈｅｎｂａｏ邋ｐｉｌｌ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ逡逑＊＊逡逑Ｃ邐一逡逑＊逡逑１５－ｊ邐逡逑＿邋ｓ逡逑Ｉｆｔｌｌｕ逡逑６邋ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋Ｚｈｅｎｂａｏ邋ｐｉｌｌ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ逡逑圖３用不同劑量珍寶丸治療ＳＣＩ大鼠后，評估神經(jīng)功能。逡逑Ａ．

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2781270