【摘要】：目的基于中醫(yī)“氣血-腦髓”相關(guān)理論,以SCF/c-kit信號調(diào)節(jié)通路為研究切入點(diǎn),建立MCAO/R大鼠模型,采用新安王氏內(nèi)科特色治法益氣活血通絡(luò)法及其代表方(腦絡(luò)欣通)對其進(jìn)行干預(yù),動態(tài)觀察模型大鼠缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)區(qū)血管再生情況及STAT3、Raf-1、MMP-9、CD105等蛋白變化,探討益氣活血通絡(luò)法對腦缺血后血管再生及其SCF/c-kit信號調(diào)節(jié)通路的影響和作用機(jī)制,為益氣活血通絡(luò)法及其代表方腦絡(luò)欣通的臨床合理應(yīng)用和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法健康雄性SD大鼠84只,體重300±20g,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、腦絡(luò)欣通組和通心絡(luò)組,每組各21只,各組下再設(shè)亞組,分別為再灌注3天、7天、14天,每亞組各7只。采用改良線栓法建立MCAO/R大鼠模型,閉塞2小時,再灌注,按照Zea Longa評分標(biāo)準(zhǔn),神經(jīng)缺損體征評分2~3分入選。按照人和大鼠體表面積折算系數(shù)進(jìn)行等效計(jì)量,腦絡(luò)欣通和通心絡(luò)分別按1.143g/kg、0.033g/kg的劑量,每天灌胃2次,分別于3天、7天、14天后心臟內(nèi)灌注,開顱取腦。HE染色法觀察各時間點(diǎn)不同組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)病理組織變化情況。免疫組化Envision二步法分別檢測各時間點(diǎn)不同組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)MMP-9、CD105蛋白表達(dá)的陽性面積數(shù)值。Western-Blot法檢測各時間點(diǎn)不同組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)STAT3、Raf-1蛋白相對灰度表達(dá)量。所得計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,使用IBM SPSS Statistics 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,同一時間點(diǎn)不同組間采用單因素方差分析,LSD進(jìn)行兩兩比較,以P0.01或P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖采用GraphPad Prism 5軟件制作,統(tǒng)計(jì)表使用word 2010軟件制作。結(jié)果HE染色法結(jié)果顯示:假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊,組織細(xì)胞形態(tài)正常。與假手術(shù)組相比,模型組各時間點(diǎn)組織水腫、神經(jīng)元變性壞死表現(xiàn)明顯,并伴有炎性細(xì)胞浸潤,以3天反應(yīng)最為明顯。采用腦絡(luò)欣通和通心絡(luò)干預(yù)后,各組各時間點(diǎn)的損傷較之模型組有不同程度減輕,神經(jīng)元變性、壞死減少,核固縮減輕,炎癥細(xì)胞浸潤有所改善。腦絡(luò)欣通組和通心絡(luò)組對比,無明顯差異。免疫組化結(jié)果顯示:MMP-9主要表達(dá)在缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿中。CD105的黃褐色沉淀主要在缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)區(qū)的血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中。不同組別再灌注3天、7天、14天時MMP-9、CD105表達(dá)差別總體均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。假手術(shù)組大鼠大腦額頂葉皮質(zhì)區(qū)MMP-9、CD105蛋白在不同時間點(diǎn)均有少量表達(dá)。模型組MMP-9、CD105蛋白表達(dá)的陽性面積以3天組為峰值,7天、14天有所下降。與假手術(shù)組相比,各同時間點(diǎn)模型組MMP-9、CD105蛋白表達(dá)的陽性面積均有明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。腦絡(luò)欣通組和通心絡(luò)組MMP-9、CD105蛋白表達(dá)的陽性面積在各時間點(diǎn)明顯上升,以3天最高,7天、14天逐漸降低,且均顯著高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。與通心絡(luò)組比較,腦絡(luò)欣通組各時間點(diǎn)MMP-9蛋白表達(dá)的陽性面積差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western-Blot結(jié)果顯示:不同組別再灌注3天、7天、14天時STAT3、Raf-1表達(dá)差別總體均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。假手術(shù)組腦組織中有少量STAT3、Raf-1表達(dá),與假手術(shù)組相比,模型組各時間點(diǎn)STAT3、Raf-1蛋白表達(dá)量均有明顯上升(P0.01)。腦絡(luò)欣通組和通心絡(luò)組各時間點(diǎn)的STAT3、Raf-1蛋白表達(dá)量明顯高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。腦絡(luò)欣通組與通心絡(luò)組相比,各時間點(diǎn)STAT3、Raf-1蛋白表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論在課題組前期對SCF、c-kit蛋白及局部腦血流量研究的基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)益氣活血通絡(luò)法及其代表方腦絡(luò)欣通上調(diào)CD105蛋白的表達(dá),腦缺血后血管再生數(shù)量增加;上調(diào)STAT3、Raf-1、MMP-9蛋白的表達(dá),調(diào)節(jié)SCF/c-kit信號通路,促進(jìn)腦缺血再灌注后的血管再生,對抗局灶性腦缺血再灌注損傷,發(fā)揮治療作用。
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖 1. 模型制作示意簡化圖、神經(jīng)功能缺損體征示意圖Fig1. Model production and neurological deficit sign schematic drawing of the mod2.3 取材和保存大鼠造模給藥 3 天、7 天、14 天后，分別于第 4 天、第 8 天、第 15 天上00 時，以 3.5%水合氯醛腹腔注射，麻醉后進(jìn)行心臟內(nèi)灌流固定，迅速冰面取腦，去除腦干、小腦，保留端腦部分，靜置于配好的 10%福爾馬林固定意固定液體積應(yīng)是組織體積 10 倍以上以確保固定液完全覆蓋腦組織，4℃藏，固定一周后備用。2.4 組織處理（1）修塊：取出標(biāo)本，流水沖洗固定液，組織修塊（前至視交叉，后修三分之放入包埋盒。

17A:假手術(shù)組 B：模型組 C：通心絡(luò)組 D：腦絡(luò)欣通組圖 2. 各組大鼠缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)區(qū)再灌注 3 天組織病理學(xué)形態(tài) ( HE，×200)Fig2. Histopathological morphology of the ischemic lateral frontoparietal cortex of each groupreperfused for 3 days(HE, ×200)

A:假手術(shù)組 B：模型組 C：通心絡(luò)組 D：腦絡(luò)欣通組圖 4. 各組大鼠缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)區(qū)再灌注 14 天組織病理學(xué)形態(tài)( HE，×200)Fig4. Histopathological morphology of the ischemic lateral frontoparietal cortex of each groupreperfused for 14 days(HE, ×200).2 益氣活血通絡(luò)法對大鼠腦缺血再灌注損傷后 MMP-9 蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果顯示：400 倍視野下，MMP-9 主要表達(dá)在缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿中。不同組別再灌注 3 天、、14 天時 MMP-9 表達(dá)差別總體均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。假手術(shù)組大鼠大頂葉皮質(zhì)區(qū) MMP-9 蛋白在不同時間點(diǎn)均有少量表達(dá)。模型組 MMP-9 蛋白的陽性面積以 3 天組為峰值，7 天、14 天有所下降。與假手術(shù)組相比，各同點(diǎn)模型組 MMP-9 蛋白表達(dá)的陽性面積均有明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

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本文編號：2774719