【摘要】：天然藥物具有多靶點和低毒性的特點,因此可作為潛在的神經(jīng)保護劑。皂苷對神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷的神經(jīng)保護作用的報道越來越多:其可通過直接促進細胞存活、改善突觸可塑性來促進神經(jīng)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡再生。輻射誘發(fā)大腦氧化應激水平和炎癥反應的發(fā)生,從而影響認知功能和神經(jīng)元的結(jié)構(gòu),最終會導致神經(jīng)發(fā)生、分化和細胞凋亡的異常變化。黃芪甲苷(AS-Ⅳ)是黃芪主要活性成分之一,以抗氧化、抗高血壓、抗糖尿病、抗梗塞、抗炎癥、抗凋亡和促進傷口愈合、血管再生等一系列保護作用而聞名。大量文獻表明,AS-Ⅳ抗凋亡的作用與改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)各種疾病有關(guān),但目前關(guān)于AS-Ⅳ對輻射誘導神經(jīng)細胞凋亡的保護機制鮮有研究報道。本研究通過輻射造模,探討AS-Ⅳ對輻射誘導的體內(nèi)外腦細胞凋亡的抗性機制,為抗輻射的中藥材活性分子和腦保健品的開發(fā)提供理論基礎。方法:1.體內(nèi)試驗:以昆明小鼠為研究對象,隨機分為5組,每組20只:空白對照組(Control)、溶劑組(DMSO)、溶劑+輻射組(DMSO+R)、低濃度AS-Ⅳ+輻射組(AS-Ⅳ-L+R)、高濃度AS-Ⅳ+輻射組(AS-Ⅳ-H+R)。試驗采用腹腔注射的方法,每天一次,進行給藥。Control組給予生理鹽水,DMSO組和DMSO+R組都給予DMSO,且終濃度不能超過0.01%。AS-Ⅳ-L+R組和AS-Ⅳ-H+R組給藥量分別為20 mg/kg和40 mg/kg,給藥30 d后,進行8 Gy ~(60)Coγ射線全身一次性均勻輻射。輻射一周后,采集大腦組織樣和分子樣。大腦切片進行TUNEL染色顯示凋亡情況,Western Blotting檢測小鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白表達量的變化。2.體外試驗:以神經(jīng)樣細胞PC12為研究對象,分為5個組:空白對照組(Control)、溶劑組(DMSO)、溶劑+輻射組(DMSO+R)、低濃度AS-Ⅳ+輻射組(AS-Ⅳ-L+R)、高濃度AS-Ⅳ+輻射組(AS-Ⅳ-H+R)。Control組不做任何處理,DMSO組和DMSO+R組都給予DMSO,且終濃度不能超過0.01%。AS-Ⅳ-L+R組和AS-Ⅳ-H+R組給藥量分別為25μg/mL和50μg/mL,細胞貼壁后,加藥,長至70%?80%后進行紫外輻射處理,劑量為6.5 J/cm~2。流式細胞術(shù)檢測PC12細胞凋亡情況,Western Blotting檢測PC12細胞凋亡相關(guān)蛋白表達量的變化。結(jié)果:1.體內(nèi)試驗:小鼠大腦切片TUNEL染色結(jié)果顯示:與Control組相比,DMSO+R組中細胞凋亡率極顯著上升(P0.001),與DMSO+R組相比,AS-Ⅳ-H+R組細胞凋亡率下降,差異具有顯著性(P0.05)。Western Blotting的結(jié)果顯示:與Control組相比,DMSO+R組的JNK和p38的蛋白磷酸化水平呈現(xiàn)顯著上升趨勢(P0.05;P0.01);p53、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表達水平和Bax與Bcl-2的比值均呈現(xiàn)顯著上升趨勢(P0.05;P0.001;P0.001;P0.001);JNK和p38的蛋白表達水平?jīng)]有顯著性差異(P0.05)。與DMSO+R組相比,AS-Ⅳ-L+R組的JNK和p38的蛋白磷酸化水平呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P0.05);p53、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表達水平和Bax與Bcl-2的比值均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P0.05;P0.001;P0.001;P0.01);JNK和p38的蛋白表達水平?jīng)]有顯著性差異(P0.05)。2.體外試驗:流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,與Control組相比,DMSO+R組中細胞凋亡率極顯著上升(P0.001),與DMSO+R組相比,AS-Ⅳ-H+R組細胞凋亡率下降,差異具有顯著性(P0.01)。Western Blotting的結(jié)果顯示:與Control組相比,DMSO+R組的JNK和p38的蛋白磷酸化水平呈現(xiàn)顯著上升趨勢(P0.001);p53、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表達水平和Bax與Bcl-2的比值均呈現(xiàn)顯著上升趨勢(P0.001;P0.001;P0.001;P0.01);JNK和p38的蛋白表達水平?jīng)]有顯著性差異(P0.05)。與DMSO+R組相比,AS-Ⅳ-L+R組的JNK和p38的蛋白磷酸化水平呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P0.01);p53、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表達水平和Bax與Bcl-2的比值均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P0.001;P0.001;P0.01;P0.01);JNK和p38的蛋白表達水平?jīng)]有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:1.AS-Ⅳ可有效降低輻射誘導腦細胞的凋亡。2.AS-Ⅳ對輻射誘導腦細胞抗凋亡的作用機制可能與JNK-p38的磷酸化調(diào)節(jié)有關(guān)。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

色法顯示 AS-Ⅳ對輻射誘導小鼠大腦細胞凋亡的影響圖（標尺為 50 μm）。（B）小鼠大腦細胞凋亡凋亡率統(tǒng)/組，*** P < 0.001，* P < 0.05。ELstaining showed the effect ofAS-Ⅳ on apoptosis of micUNELstaining map of mouse brain tissue sections (scale 5ptotic apoptosis rate of mouse brain cells. n = 3, *** P < 0.射誘導小鼠大腦細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響驗結(jié)果如圖 3-2A 所示，AS-Ⅳ對輻射誘導小鼠體情況如下：組相比，DMSO+R 組的 JNK 和 p38 的蛋白磷酸-2C：P<0.05；圖 3-2E：P<0.01）；p53、Caspa和 Bax 與 Bcl-2 的比值均呈現(xiàn)顯著上升趨勢（圖.001；圖 3-2I：P< 0.001；圖 3-2G：P< 0.001）；顯著性差異（圖 3-2B：P>0.05；圖 3-2D：P>

24圖 3-2 AS-Ⅳ對輻射誘導小鼠大腦細胞凋亡相關(guān)蛋白表達及其磷酸化水平的影響。（A）為凋亡相關(guān)蛋白及其磷酸化水平的 Western Blotting 檢測圖。（B-I）分別為小鼠大腦中 JNK、p-JNK、p38、p-p38、p53、Bax/Bcl-2、Caspase-9 和 Caspase-3 蛋白相對灰度值變化統(tǒng)計圖。n > 3，*** P < 0.001，** P < 0.01，* P < 0.05。Figure 3-2 Effect ofAS-Ⅳ on apoptosis-related protein expression and phosphorylation in brainof radiation-induced animal models. (A) Western Blotting assay for apoptosis-related proteins andtheir phosphorylation levels. (B-I) Statistical plots of relative gray value changes of JNK, p-JNK,p38, p-p38, p53, Bax / Bcl-2, Caspase-9 and Caspase-3 proteins in animal models, respectively.n > 3, *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05.

26圖 3-3 AS-Ⅳ對輻射誘導 PC12 細胞凋亡水平的影響。（A-E）為 Control 組、DMSO 組、DMSO + R 組、AS-Ⅳ-L+ R 組和 AS-Ⅳ-H + R 組的 PC12 細胞凋亡情況散點圖。（F）上述每組 PC12 細胞凋亡情況統(tǒng)計結(jié)果圖。n > 3，*** P < 0.001，** P < 0.01。Figure 3-3 Effect ofAS-Ⅳ on radiation-induced apoptosis in PC12 cells. (A-E) Scatter plot ofPC12 cell apoptosis in Control group, DMSO group, DMSO + R group,AS-Ⅳ-L+ R group andAS-Ⅳ-H + R group. (F) Statistical results of apoptosis in each group of PC12 cells. n > 3, *** P <0.001, ** P < 0.01.

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