發(fā)布時間：2020-07-29 10:42

【摘要】：研究目的:卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,死亡率在婦科腫瘤中位居首位。順鉑和紫杉醇是卵巢癌的治療中最常用的化療藥物,最初治療時都會有比較好的療效,但是只有少部分的患者可被治愈,超過75%的病人仍會復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)的患者會從化療敏感轉(zhuǎn)化為化療耐受,導(dǎo)致治療效果不佳。所以,迫切需要尋找新的藥物用于卵巢癌的臨床治療。目前,中藥在抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域受到許多關(guān)注。有研究者從廣東民間常用的消腫止痛、抗腫瘤中藥中選出25種中藥,使用不同方法進(jìn)行提取純化,發(fā)現(xiàn)重樓和地膽草的醇提物對鼻咽癌CNE1細(xì)胞的增殖抑制效果最佳。白花地膽草(Elephantopus mollis H.B.K.)為菊科地膽草屬植物,是我國長江以南地區(qū)最為常用的民間藥物。本課題組發(fā)現(xiàn)從白花地膽草中分離得到的倍半萜內(nèi)酯類單體EM-12對腫瘤細(xì)胞具有良好的增殖抑制效果,然而關(guān)于它的藥理學(xué)分子機(jī)制卻是未知的。所以,我們進(jìn)一步探討EM-12對人卵巢癌細(xì)胞的促凋亡作用及其分子機(jī)制。研究方法:MTT實(shí)驗(yàn)與克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力;臺酚藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性;RNA-Seq檢測轉(zhuǎn)錄組的變化;RT-qPCR檢測相關(guān)基因的mRNA水平;免疫印跡檢測相關(guān)蛋白的水平;透射電鏡檢測亞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平;分子克隆構(gòu)建質(zhì)粒;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染建立瞬時表達(dá)或敲低細(xì)胞株;分子對接預(yù)測藥物與蛋白的相互作用;免疫共沉淀技術(shù)檢測蛋白之間的結(jié)合;體外ATP酶活性測定實(shí)驗(yàn)檢測ATP酶活性。研究結(jié)果:基于本課題組前期的研究結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)EM-12對鼻咽癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖抑制作用。因此我們推測EM-12對于卵巢癌細(xì)胞也具有良好的增殖抑制效果。通過MTT法檢測EM-12對于卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制效果,我們發(fā)現(xiàn)EM-12可以顯著的抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖,而對于正常卵巢上皮細(xì)胞增殖抑制效果不顯著。我們以A2780細(xì)胞為研究對象,進(jìn)一步研究EM-12抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。通過RNA-Seq測序與GO功能分析,我們發(fā)現(xiàn)EM-12可以顯著激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路。通過RT-qPCR與免疫印跡,我們發(fā)現(xiàn)未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)mRNA與蛋白水平被EM-12上調(diào),且相關(guān)蛋白發(fā)生磷酸化激活;通過透射電鏡檢測細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài),我們發(fā)現(xiàn)EM-12處理細(xì)胞后使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生膨脹。由此證明,EM-12的確誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。通過免疫印跡,我們發(fā)現(xiàn)EM-12處理細(xì)胞后BCL-2蛋白水平下調(diào),總的Caspase-9、Caspase-3蛋白水平減少,并且PARP出現(xiàn)切割。這說明EM-12的確可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步地,敲低CHOP可以逆轉(zhuǎn)EM-12所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。由此證明,EM-12通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。接下來,我們探討EM-12誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子機(jī)制。BiP是熱休克蛋白HSP70家族的成員,它可以依靠NBD結(jié)構(gòu)域的ATP酶活性來發(fā)揮其分子伴侶的功能輔助蛋白質(zhì)的折疊;并且,BiP可以通過NBD結(jié)構(gòu)域與IRE1α、PERK、ATF6結(jié)合,抑制未折疊蛋白反應(yīng)通路的激活。所以,BiP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控中具有至關(guān)重要的作用。那么,我們猜測EM-12可能通過靶向BiP的NBD結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。所以,通過分子對接研究EM-12與BiP的相互作用,我們發(fā)現(xiàn)EM-12可以與BiP的NBD結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合;通過體外ATP酶活性的測定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EM-12的確可以抑制BiP的ATP酶活性;而通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測,我們發(fā)現(xiàn)EM-12可以阻斷BiP與IRE1α、PERK的結(jié)合;由此證明,EM-12的確可以競爭性結(jié)合BiP的NBD結(jié)構(gòu)域,并且抑制其ATP酶活性,從而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。既然,EM-12可以通過靶向BiP的NBD結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而介導(dǎo)內(nèi)源性凋亡導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。那么,EM-12對于其他癌種的腫瘤細(xì)胞是否也具有相同的藥理作用?通過免疫印跡檢測未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)蛋白水平與流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,我們發(fā)現(xiàn)EM-12對于肝癌、鼻咽癌、乳腺癌也具有相同的藥理作用。同時,我們發(fā)現(xiàn)EM-12對于紫杉醇耐藥的卵巢癌細(xì)胞也具有相同的促凋亡作用。結(jié)論:(1)EM-12可以通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。同時,EM-12對于正常卵巢上皮細(xì)胞的毒性較小。(2)EM-12通過靶向BiP的NBD結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。(3)EM-12可以通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、及對紫杉醇耐藥的卵巢癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

究 EM-12 對人卵巢癌細(xì)胞的促凋亡作用及其分子機(jī)制。為 EM-12 將來應(yīng)用于床治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與未折疊蛋白反應(yīng)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum）是真核細(xì)胞中最大細(xì)胞器[24]。它主要的功能是的合成、加工、折疊、運(yùn)輸，與分泌[25]。饑餓、缺氧、基因突變、鈣離子紊的超負(fù)荷等因素可以引起大量未折疊或者錯誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積，導(dǎo)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡及功能發(fā)生紊亂，這一過程被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER Stress，ERS）了存活，進(jìn)化出一種針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時細(xì)胞內(nèi)的最認(rèn)為是一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，其目的在于恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，胞生存[27]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ER Stress Response）既要增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蛋白質(zhì)和降解能力，又要降低進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)數(shù)量來減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān)。這些未折疊蛋白反應(yīng)（unfolding protein response, UPR）來完成[28]。

暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文侶參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊與組裝，幫助未折疊及錯誤折疊的蛋白質(zhì)正確的折疊與組裝，或者使錯誤折疊及未折疊的蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑（ER-associated proteindegradation，ERAD），其在調(diào)節(jié)未折疊蛋白反應(yīng)上起著重要作用[29]。如圖 2 所示，在細(xì)胞處在未發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或生理水平內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，BiP 通過它的 NBD 結(jié)構(gòu)域與IRE1α、PERK、ATF6 結(jié)合，抑制 IRE1α、PERK、ATF6 的激活；當(dāng)細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平上升時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白與錯誤折疊蛋白的累積，導(dǎo)致 BiP 從 IRE1α、PERK、ATF6解離下來，主動與未折疊蛋白發(fā)生結(jié)合，幫助它們進(jìn)行正確折疊或者幫助它們進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑。解離后，三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白 IRE1α、PERK、ATF6 激活，啟動未折疊蛋白反應(yīng)[30]。未折疊蛋白反應(yīng)可以通過以下 3 條通路激活：

圖 3：未折疊蛋白反應(yīng)與細(xì)胞存活（摘自：Guohui Wang, Zeng-Quan Yang, Kezhong Zhang, et al. Am J Transl Res. 2010）1.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡（apoptosis）是由基因控制的細(xì)胞自主、有序的死亡，它可以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[51]。其特征是細(xì)胞形態(tài)由正常形態(tài)開始變圓、變小，細(xì)胞核凝集破碎，胞質(zhì)皺縮內(nèi)陷，從而形成大量的凋亡小體[52]。細(xì)胞凋亡途徑主要有三種：死亡受體凋亡途徑、線粒體凋亡途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平上升時，未折疊蛋白反應(yīng)致力于恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。如果，細(xì)胞處于過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，凋亡信號將被啟動。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡有多種途徑，如 Caspase 依賴途徑、CHOP 依賴途徑等[53;54]。CHOP 依賴的凋亡途徑是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致凋亡的主要通路[55;56]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過激活未折疊蛋白反應(yīng)，誘導(dǎo) CHOP 的表達(dá)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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本文編號：2773854