【摘要】：目的:探討枳實對衣霉素誘導(dǎo)的Cajal間質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78、ATF6的影響。方法:(1)采用酶解法分離原代大鼠胃間質(zhì)細胞(Interstitial cells of Cajal,ICCs),免疫熒光染色法鑒定ICCs細胞c-kit抗體;采用CCK-8法檢測不同濃度(0μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml)衣霉素(Tunicamycin,Tm)作用于ICCs不同時間(12h、24h、48h)對細胞活性的影響;qRT-PCR法檢測ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵分子GRP78 mRNA的表達;透射電子顯微鏡觀察ICCs的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)。(2)枳實對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激ICCs的影響:采用血清藥理學(xué)通法制備枳實含藥血清,抑制劑4-PBA阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。隨機將細胞分為:空白對照組(ICCs正常培養(yǎng))、Tm模型組(1μg/ml Tm處理ICCs)、4-PBA組(1μg/ml TM+10mM 4-PBA聯(lián)合作用)和枳實組(1μg/ml Tm+20%枳實含藥血清聯(lián)合作用),每組細胞均作用24h后用于檢測:采用透射電子顯微鏡觀察各組ICCs的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu);微板法測定各組ICCs的乳酸脫氫酶(LDH)活性;熒光酶標(biāo)儀測定各組ICCs的ROS水平;CCK-8法檢測各組ICCs的細胞活性;細胞劃痕實驗觀察各組ICCs細胞的遷移修復(fù)能力;Elisa法、qRT-PCR法、Western blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78和ATF6的表達。結(jié)果:(1)光鏡下ICCs呈梭形、三角形、星型等,伴有細長的分枝狀突起,細胞質(zhì)較少,胞核大,與周圍細胞間形成突觸鏈接,免疫熒光染色法可見c-kit呈陽性表達;采用CCK-8法檢測Tm對細胞活性的影響:當(dāng)Tm濃度為2μg/ml時,Tm作用于ICCs 12h、24h、48h時細胞活性均降低,12h、24h、48h細胞活性(OD值)分別為0.553±0.026(P0.05)、0.466±0.046(P0.05)、0.164±0.034(P0.05);當(dāng)Tm濃度為1μg/ml,Tm作用于ICCs 24h、48h時細胞活性均降低,24h、48h細胞活性(OD值)分別為0.736±0.008(P0.05)、0.359±0.079(P0.05);qRT-RCR結(jié)果顯示:與0μg/ml Tm比較,1μg/ml Tm作用于ICCs 24h后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵分子GRP78 mRNA表達升高,且有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);透射電子顯微鏡結(jié)果顯示:空白對照組ICCs培養(yǎng)24h后,細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)形態(tài)完整,排列整齊;1μg/ml Tm作用于ICCs 24h后,細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)腫脹、擴張、斷裂、呈囊泡化、脫顆粒改變。(2)枳實對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激ICCs的影響:透射電子顯微鏡結(jié)果顯示,空白對照組ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)完好,Tm模型組ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、擴張、呈囊泡化、脫顆粒改變,4-PBA組ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂、擴張,枳實組ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、呈局限性擴張;各組ICCs的LDH活性比較:與空白對照組比較,Tm模型組、4-PBA組、枳實組細胞LDH活性均升高(P0.05);與Tm模型組比較,4-PBA組、枳實組細胞LDH活性均降低(P0.05);各組ICCs的ROS含量比較:與空白對照組比較,Tm模型組、4-PBA組、枳實組細胞ROS含量均升高(P0.05);與Tm模型組比較,4-PBA組、枳實組細胞內(nèi)ROS含量均降低(P0.05);在倒置熒光顯微鏡下可見,Tm模型組細胞內(nèi)的熒光強度較強;而經(jīng)抑制劑、枳實含藥血清處理后細胞內(nèi)的熒光強度減弱;各組ICCs存活率比較:與空白對照組比較,其余各組ICCs的存活率均降低(P0.05);與Tm模型組比較,枳實組ICCs的存活率升高(P0.05);細胞劃痕實驗結(jié)果顯示:相同時段內(nèi)ICCs組細胞間距隨著隨時間推移縮小。培養(yǎng)12h后,空白對照組細胞劃痕愈合率為(38.0±2.0)%、Tm模型組細胞劃痕愈合率為(19.7±4.5)%、4-PBA組細胞劃痕愈合率為(26.3±3.7)%、枳實組細胞劃痕愈合率為(30.0±2.0)%;培養(yǎng)24h后,空白對照組細胞劃痕愈合率為(31.0±2.0)%、Tm模型組細胞劃痕愈合率為(7.0±3.6)%、4-PBA組細胞劃痕愈合率為(35.7±2.1)%、枳實組細胞劃痕愈合率為(38.3±3.1)%;與Tm模型組相比,枳實組ICCs劃痕愈合率高(P0.05);Elisa法檢測各組細胞GRP78、ATF6蛋白含量結(jié)果顯示:與空白對照組比較,Tm模型組、4-PBA組、枳實組GRP78、ATF6蛋白含量均升高(P0.05);與Tm模型組比較,4-PBA組、枳實組的GRP78、ATF6蛋白含量均降低(P0.05);qRT-PCR法檢測GRP78、ATF6mRNA表達結(jié)果,與空白對照組比較,Tm模型、4-PBA組、枳實組GRP78、ATF6 mRNA表達均升高(P0.05);與Tm模型組比較,枳實組GRP78、ATF6 mRNA表達均降低(P0.05);與4-PBA組比較,枳實組GRP78 mRNA表達降低(P0.05);Western blot法檢測各組細胞GRP78、ATF6蛋白表達結(jié)果,與空白對照組比較,Tm模型組、4-PBA組、枳實組GRP78、ATF6蛋白表達均升高(P0.05);與Tm模型組比較,4-PBA組、枳實組的GRP78、ATF6表達均降低(P0.05)。結(jié)論:使用衣霉素成功構(gòu)建大鼠胃ICCs細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的模型;枳實可減輕由衣霉素誘導(dǎo)的ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷,提高受損細胞生長活性、改善細胞運動修復(fù)能力,這可能與其抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激ATF6通路有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖 1-1 ICCs 生長形態(tài)及免疫熒光鑒定（×100）Fig.1-1 Morphology and immunofluorescence identification of ICCs (×100).1.2 ICCs 細胞生長及形態(tài)觀察

2 不同培養(yǎng)時間的 ICCs 細胞形態(tài)2 The ICCs morphology at different culture timesculh 后 ICCs（×100） B 3d 后 ICCs（×100）eight hours later, ×100） ICCs（three days later, ×100）d 后 ICCs（×100） D 7d 后 ICCs（×100）five days later, ×100） ICCs（seven days later, ×100）構(gòu)建 ICCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細胞模型1 Tm 對 ICCs 活性的影響CCK8 結(jié)果顯示，當(dāng) Tm 濃度為 2μg/ml 時，ICCs 存活率顯著下降m 濃度升高，ICCs 存活率逐漸下降，而 Tm 濃度為 0μg/ml、0.125μgμg/ml、0.5μg/ml 時，各組細胞存活率無顯著差異。當(dāng) Tm 濃度為 1μg 24h、48h，細胞存活率均降低（P＜0.05），考慮到誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

3.2.3 透射電子顯微鏡觀察 ICCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)變化結(jié)果如圖 1-3 所示，空白對照組 ICCs 內(nèi)可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)完整、排列整齊，如圖 1-3A；當(dāng) Tm 濃度為 1μg/ml Tm，作用于 ICCs24h 后，ICCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、擴張、呈囊泡化、相互離散及脫顆粒改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞明顯，

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 魯軒浩;趙連友;張志敏;王繼鵬;周巖芬;王增強;;高血壓伴高同型半胱氨酸血癥大鼠心肌ATF6和CHOP表達對左室肥厚的影響及依葉片干預(yù)效果[J];中國循證心血管醫(yī)學(xué)雜志;2016年06期

2 閆東;崔新征;吉文仲;閔建軍;吉慶春;任景麗;;未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)因子GRP78、ATF6和XPB1在人食管鱗狀細胞癌中的表達及其意義[J];診斷病理學(xué)雜志;2014年05期

3 趙文君;朱慧芳;周菁華;李祥柱;劉艷娜;郭風(fēng)勁;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對ATF6調(diào)控XBP1啟動子轉(zhuǎn)錄的影響[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2012年04期

4 薛欣;趙京元;張永祥;;腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)ATF6、IRE1介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)[J];毒理學(xué)雜志;2008年06期

5 胡躍強;唐農(nóng);吳林;胡玉英;黃麗鵬;來要水;;清熱化瘀顆粒對腦缺血預(yù)處理大鼠ATF6表達的影響[J];時珍國醫(yī)國藥;2014年07期

6 張毓;孟鳳琴;張薔;卜暉;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子ATF6在hSOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓中的表達[J];腦與神經(jīng)疾病雜志;2016年03期

7 李紅玲,王保國,龐煒,朱毅;肝細胞中活化轉(zhuǎn)錄因子ATF6抑制SREBP1的轉(zhuǎn)錄活性[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2005年04期

8 商躍云;張慧;林書祥;舒劍波;;膿毒癥患兒外周血CD_4~+T細胞Bip、ATF6及DDIT3表達水平變化[J];陜西醫(yī)學(xué)雜志;2019年06期

9 付饒;李會玲;王磊;楊迪琦;溫鑫;靳亞平;;山羊ATF6基因重組慢病毒干擾載體的構(gòu)建及鑒定[J];動物醫(yī)學(xué)進展;2019年05期

10 ;我國學(xué)者揭示ATF6調(diào)節(jié)人干細胞衰老新機制[J];健康之友;2018年03期

相關(guān)會議論文 前5條

1 姚樹桐;�；�;宗傳龍;楊娜娜;焦鵬;宋國華;張穎;秦樹存;;ATF6介導(dǎo)氧化低密度脂蛋白所誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和凋亡[A];第11屆全國脂質(zhì)與脂蛋白學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2012年

2 萬姜敏;杜曉剛;;ATF6在棕櫚酸誘導(dǎo)的足細胞脂質(zhì)聚集及凋亡中的作用[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會腎臟疾病專業(yè)委員會2018年學(xué)術(shù)年會論文摘要匯編[C];2018年

3 萬姜敏;杜曉剛;;ATF6在棕櫚酸誘導(dǎo)的足細胞凋亡中的作用[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會腎臟疾病專業(yè)委員會2015年學(xué)術(shù)年會資料匯編[C];2015年

4 胡承;賈偉平;張蓉;萬慧;馬曉靜;王從容;方啟晨;項坤三;;ATF6基因Ala145Pro變異與中國人糖脂代謝的關(guān)聯(lián)研究[A];2006年中華醫(yī)學(xué)會糖尿病分會第十次全國糖尿病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2006年

5 薛欣;張永祥;;腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)ATF6、IRE1介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 賈維坤;ATF6在增加慢性缺氧心肌耐受急性缺血再灌注損傷中的作用及機制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 王叢叢;ATF6在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的HepG2細胞自噬與凋亡中作用機制的研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 蹇朝;CUEDC2和ATF6α調(diào)控心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致細胞凋亡作用的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王遠;枳實對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激Cajal間質(zhì)細胞GRP78、ATF6的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

2 張薔;ATF6在家族性肌萎縮側(cè)索硬化模型中的表達變化[D];河北醫(yī)科大學(xué);2010年

3 管棟印;對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)含巰基抗氧化物引起的凋亡機制和ATF6βN糖基化功能探討[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

4 王巧玲;eIF2α磷酸化及ATF6參與苯并（a）芘-7，8-二氫二醇-9，10-環(huán)氧化物誘發(fā)的細胞應(yīng)激反應(yīng)[D];浙江大學(xué);2010年

5 陳康梅;第一部分 HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌的遺傳易感性研究 第二部分 ATF6啟動子的結(jié)構(gòu)和功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

6 韓曉鳳;ATF6腺病毒的構(gòu)建及對軟骨細胞凋亡的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

7 隋建;未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)基因ATF6、GRP78、XBP1在人類肝細胞癌中的表達及其相關(guān)的臨床意義[D];華中科技大學(xué);2011年

8 閆東;未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)因子GRP78、ATF6和XPB1在食管鱗癌中的表達及其意義[D];鄭州大學(xué);2014年

9 趙丹琦;第一部分 ATF6對肝癌細胞系活性影響的研究 第二部分 HBV對thapsigargin引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)影響的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

10 孟鳳琴;ATF6在家族性肌萎縮側(cè)索硬化模型hSOD1~(G93A)轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓中的表達變化[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號：2773712