【摘要】：背景及目的:化學療法是臨床腫瘤患者常用的治療手段,治療過程中產(chǎn)生的原發(fā)和繼發(fā)耐藥是腫瘤化療失敗的根本原因,克服耐藥是提高腫瘤化療效果的關鍵。據(jù)美國臨床腫瘤學會(ASCO)統(tǒng)計,90%以上腫瘤患者死亡原因與腫瘤多藥耐藥(MDR)有關,其中ATP結(jié)合盒(ATP binding casssette,ABC)轉(zhuǎn)運蛋白的過表達是引起MDR的主要原因。目前為止,還沒有耐藥逆轉(zhuǎn)劑被美批準上市,從傳統(tǒng)中藥中尋找高效、低毒、專一性好的耐藥逆轉(zhuǎn)劑是研究者關注的熱點之一。靈芝三萜B8組分是從靈芝中提取分離出來的活性物質(zhì),課題組發(fā)現(xiàn)B8在低劑量下有著良好的逆轉(zhuǎn)MDR耐藥活性。本文主要評價靈芝三萜B8組分在體內(nèi)外逆轉(zhuǎn)由ABCB1介導的多藥耐藥活性作用及其機制研究。方法:(1)用MTT法測定非細胞毒濃度的靈芝三萜B8組分作用于ABCB1高表達的耐藥細胞株及對應的敏感細胞株對其底物藥物和非底物藥物的耐藥逆轉(zhuǎn)活性;(2)用RT-qPCR、Western Blot法分別檢測靈芝三萜B8組分對ABCB1基因的mRNA、P-gp蛋白表達數(shù)量變化影響;(3)通過流式細胞儀觀察靈芝三萜B8組分對羅丹明123、多柔比星的蓄積以及對多柔比星外排影響;(4)采用Pgp-Glo~TMM ATPase試劑盒體外檢測靈芝三萜B8組分對ABCB1 ATP酶活性的影響;(5)使用P450-Glo~TMM Screening System試劑盒體外檢測靈芝三萜B8組分對腫瘤藥物代謝肝藥酶CYP3A4活性的影響;(6)通過建立ICR小鼠肝癌H_(22)皮下移植瘤模型,觀察靈芝三萜B8組分對口服紫杉醇抗腫瘤作用的影響,探討靈芝三萜B8組分對腸黏膜P-糖蛋白轉(zhuǎn)運體的影響;(7)通過建立裸鼠KBv200皮下移植瘤模型,觀察靈芝三萜B8組分聯(lián)合長春新堿對KBv200皮下移植瘤的抑制作用,探討靈芝三萜B8組分體內(nèi)逆轉(zhuǎn)耐藥的作用;(8)采用HPLC法觀察靈芝三萜B8組分處理組對抗癌藥物紫杉醇藥物代謝動力學的影響作用。結(jié)果:(1)靈芝三萜B8組分作用于各高表達P-gp耐藥株相對于各親本細胞株的毒性較為不敏感;(2)非細胞毒濃度的靈芝三萜B8組分作用于高表達P-gp細胞株對于P-gp底物藥物多柔比星、紫杉醇、長春新堿有著逆轉(zhuǎn)耐藥的效果,并隨著靈芝三萜B8組分的劑量提高逆轉(zhuǎn)倍數(shù)也隨之增加,然而對非P-gp底物藥物順鉑則無逆轉(zhuǎn)耐藥效果,同時對親本細胞株幾乎無增效作用;(3)靈芝三萜B8組分能顯著性增加對P-gp底物羅丹明123以及多柔比星的蓄積量;同時對多柔比星的外排功能起到抑制作用;(4)靈芝三萜B8組分對ABCB1基因mRNA、P-gp的表達數(shù)量上無差異變化;(5)靈芝三萜B8組分對腫瘤藥物代謝肝藥酶CYP3A4活性的抑制影響呈藥物梯度依賴性,靈芝三萜B8組分低濃度(2μg/mL)對代謝肝藥酶CYP3A4活性抑制程度較弱;(6)靈芝三萜B8組分對ABCB1 ATPase活性無顯著影響;(7)靈芝三萜B8組分可能通過抑制胃腸道黏膜P-gp轉(zhuǎn)運體的功能,有效增強口服紫杉醇對小鼠皮下H_(22)移植瘤的抗腫瘤作用;(8)長春新堿(VCR)(0.5mg/kg)、B8(200mg/kg)、B8+VCR(200+0.5mg/kg)組對裸鼠KBv200皮下移植瘤的抑瘤率分別為23.12%、31.87%、59.85%。(9)通過口服靈芝三萜B8組分處理組與陰性組的比較,兩組的小鼠紫杉醇藥代動力學參數(shù)并無顯著性差異。結(jié)論:靈芝三萜B8組分在體內(nèi)外能夠有效地逆轉(zhuǎn)由ABCB1介導的耐藥作用。主要通過以下機制研究:(1)靈芝三萜B8組分抑制P-gp轉(zhuǎn)運體的功能;(2)靈芝三萜B8組分并不改變對P-gp轉(zhuǎn)運體的表達;(3)靈芝三萜B8組分低濃度(2μg/mL)對代謝肝藥酶CYP3A4活性抑制作用較弱;(4)靈芝三萜B8組分對ABCB1 ATPase活性無影響變化;(5)靈芝三萜B8組分能夠可能通過抑制胃腸道黏膜P-gp轉(zhuǎn)運體的功能,提高口服紫杉醇的生物利用度,增強其抗H_(22)腫瘤作用;(6)靈芝三萜B8組分通過逆轉(zhuǎn)由ABCB1介導的耐藥作用,提高長春新堿對高表達P-gp的KBv200皮下移植瘤的抑制水平;(7)靈芝三萜B8組分對紫杉醇藥物的代謝動力學不產(chǎn)生顯著影響;綜上研究表明了靈芝三萜B8組分在體內(nèi)外能夠有效地逆轉(zhuǎn)由ABCB1介導的耐藥作用,為分離出新型靈芝三萜單體化合物逆轉(zhuǎn)耐藥劑奠定良好的基礎。
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

37(與CTL組相比較， **， P <0.01)圖1.2靈芝三萜B8組分作用于KBv200、KB細胞對多柔比星(A)以及羅丹明123(B)的蓄積情況Figure 1.2The effect of B8 on intracellular accumulation of DOX (A) and RH123 (B)inKBv200 and KB was measured by flow cytometric analysis, respectively.3.2 靈芝三萜 B8 抑制 ABCB1 介導的多柔比星外排將多柔比星與KBv200細胞共孵育3小時后，撤去多柔比星為阻斷其蓄積來源，

38（**，P<0.01）圖1. 3靈芝三萜B8組分作用于KBv200細胞對多柔比星的外排影響Figure 1.3 Effect of B8 on the efflux of DOX on KBv2003.3 靈芝三萜 B8 對 KBv200 細胞 ABCB1 基因轉(zhuǎn)錄、翻譯水平無影3.3.1 對KBv200細胞ABCB1mRNA表達量無變化影響實時熒光定量PCR結(jié)果Tab1.4顯示，通過求得的mRNA相對表達量2^DDC較，各實驗處理組的2^DDCt均在1之間，說明各實驗組ABCB1基因在mRNA的水平上既不顯著上調(diào)也不顯著下調(diào)，并且各實驗組之間對ABCB1基因在mRNA達上無明顯差異，因此可以得出，在不同作用時間以及不同濃度梯度下的靈芝

B8 50μg/mL 72h 1.098 0.867 0.895 0.953±0.126B8 100μg/mL 72h 0.966 1.185 0.940 1.030±0.134圖1.4 靈芝三萜B8組分對KBv200細胞ABCB1 mRNA表達的影響Figure 1.4 Effect of B8 on ABCB1 mRNAexpression in KBv200 cell.

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

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本文編號：2767943