【摘要】：腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)表現(xiàn)為過量的細胞外基質(zhì)沉積,是許多慢性腎臟疾病的主要病理基礎(chǔ),造成腎臟功能的不可逆損傷,同時在糖尿病腎病中腎間質(zhì)纖維化促進病情進展,因此抑制RIF是保護腎臟的有效治療策略。中醫(yī)藥防治腎間質(zhì)纖維化有其獨特的優(yōu)勢。糖腎方(tang shen fomula,TSF)是本課題組繼承名老中醫(yī)經(jīng)驗基礎(chǔ)上,結(jié)合現(xiàn)代研究成果和臨床實踐,以益氣柔肝、活血通絡(luò)立法,組方面來。它是由黃芪,生地黃、山茱萸、三七、衛(wèi)矛、熟大黃、枳殼七味中藥組成的復方制劑。多中心臨床試驗證明TSF可以較好的防治糖尿病腎病的作用,改善血肌酐,腎小球濾過率等。針對糖腎方大孔樹脂富集、醇提以及水提的多種制備工藝,本研究利用經(jīng)典的單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruct,UUO)小鼠動物模型對糖腎方顆粒的制備工藝進行評價,以確定糖腎方最優(yōu)提取方法。確定糖腎方顆粒的制備工藝路線后,同時選用該工藝組作為糖腎方治療組。同時進行糖腎方顆粒改善腎間質(zhì)纖維化的作用機制研究。1.目的1.1利用單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型篩選糖腎方顆粒的最佳制備工藝。1.2探究糖腎方抑制小鼠單側(cè)輸尿管梗阻導致的腎間質(zhì)纖維化的作用,以及作用機制。2.方法2.1根據(jù)大孔樹脂富集、醇提、水提方法設(shè)計糖腎方制備工藝一,二,三。選用60只八周齡的雄性C57BL/6小鼠,隨機分為假手術(shù)組,模型組,糖腎方工藝路線一、二、三組以及陽性藥福辛普利組。適應(yīng)性喂養(yǎng)三天后,預(yù)給藥一周后進行單側(cè)輸尿管梗阻手術(shù),手術(shù)后一周處死小鼠。TSF組給予TSF藥物(2.4g/kg/天),福辛普利組給予福辛普利(1.5g/kg/天),假手術(shù)組和模型住給予相同體積的蒸餾水。給藥方式全部采用灌胃給藥。2.2收集血液標本后檢測血清中的肌酐,尿素氮,谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶。根據(jù)MASSON染色半定量分析評估各組小鼠的腎間質(zhì)纖維化程度。根據(jù)HE染色進行腎間質(zhì)細胞浸潤評分,評估腎小管間質(zhì)損傷程度。提取小鼠腎組織中的總RNA后,逆轉(zhuǎn)錄得到模板cDNA,并通過實時PCR分析目的基因。提取小鼠腎臟的蛋白,并將提取的蛋白進行蛋白印跡分析。同時通過免疫組化分析目的蛋白的表達水平。2.3將實驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism軟件(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA,USA)分析。分析結(jié)果表示為平均值±SD。當AP value of0.05時,被認為有統(tǒng)計學意義。3結(jié)果3.1確定糖腎方顆粒的制備工藝各工藝路線組均對UUO引起的小鼠腎病理損傷有一定的改善作用,均顯著改善腎間質(zhì)纖維化(P0.05),其中工藝路線一、三組作用更佳。工藝路線三組能顯著改善小鼠UUO后的血肌酐和尿素氮水平,顯著減少腎間質(zhì)細胞浸潤(P0.05)。糖腎方顆粒的制備工藝路線三組為水提工藝。3.2TSF改善了UUO小鼠的肝腎功能進行UUO手術(shù)后七天,小鼠腎功能會出現(xiàn)損傷,TSF治療能顯著改善UUO誘導的腎功能,同時改善肝臟功能。與假手術(shù)組相比,模型組肌酐,尿素氮,谷丙轉(zhuǎn)氨酶,谷草轉(zhuǎn)氨酶水平顯著增加,TSF治療組的血清水平下降。3.3 TSF減弱了UUO誘導的腎間質(zhì)纖維化UUO模型是一種典型的腎間質(zhì)纖維化模型。模型組αα-平滑肌肌動蛋白,纖連蛋白,波形蛋白,一型膠原的蛋白和mRNA表達顯著增加,而E-鈣黏素的蛋白和mRNA表達下降。然而,與模型組相比,在TSF組中觀察到αα-平滑肌肌動蛋白和纖連蛋白,波形蛋白,一型膠原mRNA和蛋白表達的下調(diào),同時E-鈣粘蛋白mRNA和蛋白水平的上調(diào)。兩組之間有顯著差異(圖2,P0.05)。3.4 TSF改善RIF的作用與調(diào)控TGF-β/smads信號通路有關(guān)TGF-β/Smads信號傳導通路在腎間質(zhì)纖維化中起著重要的作用。在UUO手術(shù)七天的小鼠腎臟中,免疫組化結(jié)果TGF-β1的表達顯著高于假手術(shù)組,TSF治療后TGF-β1的表達受到顯著抑制。Western blotting and qPCR的結(jié)果是一致的。同時,Western blotting的結(jié)果表明,UUO組的磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)水平顯著高于假手術(shù)組,TSF治療同樣也能抑制p-Smad2/3的表達。4.結(jié)論4.1確定糖腎方顆粒的制備工藝路線為水提工藝。4.2TSF治療可以抑制單側(cè)輸尿管梗阻導致的小鼠腎間質(zhì)的纖維化,其作用可能是與抑制TGF-β/Smads信號通路的傳導有關(guān),明顯抑制了腎間質(zhì)纖維化的標志蛋白的表達。證明了糖腎方顆粒有較好的抗腎間質(zhì)纖維化作用。
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

以顯著降低肌酐和尿素氮水平，工藝一組顯著降低肌酐水平，工藝二組顯著性降低逡逑尿素氮水平；陽性藥福辛普利的肌酐和尿素氮水平、工藝一組的尿素氮水平以及逡逑工藝二組的肌酐水平無統(tǒng)計學差異（圖１邋）。逡逑ｓｈａｍ邐ＵＵＯ邐ＴＳＦ－１逡逑ｍｍｍ逡逑ＴＳＦ－２邐ＴＳＦ－３邐Ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ逡逑４３逡逑

圖４邋ＴＳＦ備工藝組小鼠的腎小管間質(zhì)細胞浸潤評分逡逑注：數(shù)據(jù)以均數(shù)土標準誤（Ｍｅａｎ邋士邋ＳＥＭ）表示。＃＃＃Ｐ邋＜０．００１，ＵＵ０組與ｓｈａｍ組相比較；逡逑＊Ｐ＜邋０．０５，邋ＴＳＦ－１邋組及邋Ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ邋組與邋ＵＵ０邋組相比較；＊＊＊Ｐ＜邋０．００１，ＴＳＦ－３邋組及邋Ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ邋組與逡逑ＵＵＯ組相比較．逡逑４５逡逑

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本文編號：2767078