【摘要】：目的:肺癌是人類面臨的最常見的惡性腫瘤之一。近年來,肺癌的發(fā)病率迅速上升,占全球所有癌癥病例的十分之一以上,其死亡率亦位居全球癌癥致死首位,嚴重威脅著人類的健康發(fā)展。盡管根據組織學分類,肺癌分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC),但約85%的肺癌患者被診斷為NSCLC。由于當前常用的抗肺癌藥物效果欠佳、存在的毒副作用較大以及腫瘤細胞產生的抗藥性,使得手術切除仍然是NSCLC最佳的治療選擇。然而,由于NCLSC發(fā)病早期無相關特異性癥狀,且當前對肺癌的發(fā)病分子機制仍不甚明了,缺乏針對NCLSC的準確及簡易的早期診斷方法,以至于大多數肺癌患者被確診時已處于手術切除已無法救治的病理晚期。因此,深入探究肺癌的發(fā)病分子機制,尋找新的有效早期篩查、預后標志物以及挖掘安全有效治療肺癌的藥物已是亟不可待。小檗堿(Berberine,BBR)又稱為黃連素,是傳統(tǒng)中藥黃連的主要成分活性成分,廣泛存在于小檗科、防己科、罌粟科等植物當中,長期在傳統(tǒng)中藥中被用于治療胃腸道疾病。近年來,小檗堿及其衍生物被證明具有抗腫瘤活性且毒性較低,但其作用機制仍不明確。8-十六烷基小檗堿(8-BBR-C16,HBBR)是通過向BBR的C8位引入16C直鏈烷基修飾而產生的一種新BBR衍生物,課題組前期研究發(fā)現其口服吸收率、生物利用度較BBR顯著增高,并且具有較明顯的肺部靶向性,但其是否具有抗肺癌以及其它腫瘤活性仍未有報道。因此,一方面,本研究擬通過生物信息學的方法,篩選NSCLC相關差異表達基因,并通過差異蛋白間相互作用網絡關系預測、核心基因篩選及預后分析等方面探討非小細胞肺癌可能的分子機制。另一方面,通過體外及體內實驗研究HBBR對肺癌的抑制作用及其可能的分子機制。方法和結果:(1)利用生物信息學方法以及GEO數據庫中的人肺癌組織mRNA表達芯片數據集,我們比較分析了GSE21933、GSE33532、GSE44077和GSE74706數據集中NSCLC及其對應正常組織mRNA的表達水平,分別挖掘出差異上調基因:676、865、274、1797個;差異下調基因:761、1262、689、2350個;通過對四個芯片數據集差異表達基因取交集,最終獲得差異上調基因57個以及138個差異下調基因。通過對差異基因進行GO(Gene Ontology)注釋,發(fā)現上調的差異基因與細胞增殖、細胞分裂、細胞周期等生物學過程相關,下調差異基因與血管生成、細胞粘附、細胞凋亡等生物學過程相關。通過構建蛋白與蛋白相互作用(PPI)網絡,挖掘出度得分≥19的中心節(jié)點基因25個,其中CCNB1、CCNA2、CEP55、PBK以及HMMR基因得分最高。通過Oncomine的肺癌數據庫我們進一步對篩選得到的前5名中心節(jié)點基因進行了表達驗證,并且通過Kaplan Meier Plotter的肺癌病人數據庫進行預后分析后發(fā)現CCNB1、CCNA2、CEP55、PBK以及HMMR的mRNA表達水平高低與NSCLC的臨床預后顯著相關,并且其它20個中心節(jié)點基因也與NSCLC的臨床預后緊密聯(lián)系。(2)參考課題組前期的研究工作,利用格式試劑合成法,將16碳直鏈烷基取代BBR C8位的H合成HBBR。產物經結構鑒定,確定為擬研究目標產物。(3)為研究HBBR的體外抗肺癌作用,通過MTT方法分析了HBBR對于A549細胞的活力影響,發(fā)現HBBR較BBR對細胞活力的抑制作用大大提高,其半數抑制濃度(IC50)分別為2.325、27.398μg/ml;通過流式細胞儀檢測不同濃度HBBR(0、0.2、0.5、1μg/ml)給藥后A549細胞的周期分布,通過EdU增殖實驗檢測DNA合成以及western blot檢測周期相關表達蛋白,發(fā)現HBBR能夠抑制A549細胞的增殖,并且使其細胞周期阻滯于G0/G1期;運用流式細胞儀、TUNEL細胞凋亡檢測以及western blot技術,我們發(fā)現HBBR亦能夠通過誘導A549細胞發(fā)生凋亡而實現其抗腫瘤作用,并且通過分析HBBR給藥后A549細胞中CEP55、PI3K、Akt、pAkt、p21、p27的蛋白表達水平后發(fā)現,HBBR極有可能通過抑制PI3K-Akt信號通路的活性而抑制細胞生長;同時,通過細胞劃痕以及transwell細胞侵襲實驗發(fā)現,HBBR能夠顯著抑制A549細胞的遷移與侵襲能力。(4)通過在裸鼠右前肢腋下皮下接種A549細胞建立人肺癌異種移植瘤模型,接種后通過口腔灌胃給藥21天的方式研究HBBR的體內抗肺癌效果。實驗結束時,與腫瘤模型組相比,藥物組BBR(120 mg/kg)、HBBR(5 mg/kg)、HBBR(10 mg/kg)的平均離體瘤重分別降低27.47%、34.58%、59.07%。同時,通過腫瘤標志物蛋白芯片檢測荷瘤21天后裸鼠的血清腫瘤標志物水平,發(fā)現HBBR給藥后,NSE、CYFRA21-1和CA125水平顯著降低。此外,通過檢測給藥期間裸鼠的體重變化以及解剖后各小鼠的臟器系數,發(fā)現HBBR長期給藥對小鼠生長無明顯毒副作用。以上結果表明,HBBR具有較好的體內抑制肺癌生長潛力,并呈現劑量依賴關系。(5)腸道內微生態(tài)的穩(wěn)定與機體的健康及對疾病的抵抗能力息息相關,為從腸道微生物的角度探究HBBR抑制人A549肺癌細胞異種移植瘤生長的可能機制,收集動物實驗第20天正常對照組、腫瘤模型組、HBBR(10 mg/kg)組小鼠新鮮排泄的糞便,提取糞便中的基因組DNA后,通過16S rRNA基因測序方法,檢測各組腸道菌群的差異。從9個糞便樣本中獲得了685707個有效的焦磷酸測序讀數,總共鑒定了198種微生物。結果發(fā)現腫瘤模型組小鼠體內檢測到的微生物種類及豐度均低于正常對照組和HBBR組。表明HBBR的治療有利于維持小鼠體內穩(wěn)定和健康的微生態(tài)。在種水平上,本研究首次報道了HBBR給藥有利于維持Clostridium clostridioforme(梭狀梭菌)、Bacteroides acidifaciens(生酸擬桿菌)、Parabacteroides distasonis(迪氏副擬桿菌)、Lactobacillus animalis(動物乳桿菌)、Lactobacillus gasseri(格氏乳桿菌)、Lactococcus lactis(乳酸乳球菌)、Erysipelatoclostridium ramosum(多枝梭菌)以及Mucispirillum schaedleri在荷瘤小鼠腸道內的豐度。(6)采用人肺癌A549細胞荷瘤裸鼠模型和鼠源Lewis肺癌荷瘤模型同時比較HBBR單藥、紫杉醇單藥、紫杉醇聯(lián)合順鉑以及紫杉醇聯(lián)合HBBR對荷瘤小鼠腫瘤生長的作用效果,初步探究HBBR是否可以增強紫杉醇對肺癌細胞的殺傷作用。實驗結果表明,在A549細胞荷瘤裸鼠模型中,HBBR(10 mg/kg)每日口腔灌胃給藥聯(lián)合紫杉醇(12 mg/kg)每周注射1次的腫瘤抑制率(62.01%)較紫杉醇、HBBR單藥分別提高18.54%、15.06%;同時在Lewis肺癌荷瘤模型中,該組合的腫瘤抑制率(57.99%)較紫杉醇、HBBR單藥分別提高19.94%、21.66%,由此可見HBBR與紫杉醇聯(lián)合給藥有利于各自藥效的提高。結論:本研究通過分析非小細胞肺癌相關芯片數據,首次在多個數據集中挖掘出了一系列共有表達的差異基因,通過網絡數據庫及工具對差異基因進行分析后,發(fā)現NSCLC的發(fā)生與細胞周期、增殖、凋亡相關蛋白的異常表達關系極為密切。通過體內及體外實驗,首次證實小檗堿的C8位十六烷基取代物即HBBR具有抗肺癌活性且其抑制腫瘤活性與細胞周期及凋亡密切相關。通過分析HBBR給藥后荷瘤裸鼠的腸道微生物菌群,發(fā)現HBBR治療有利于維持荷瘤小鼠體內健康的腸道微生物環(huán)境。并且通過分析HBBR與紫杉醇單用及聯(lián)合給藥對荷瘤裸鼠模型以及Lewis肺癌細胞荷瘤小鼠模型皮下瘤組織生長的影響,發(fā)現HBBR聯(lián)合紫衫醇給藥有利于進一步提高單藥藥效。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

圖 1-1 R 軟件（3.4.0 版本）截圖Fig.1-1. The operation interface of R software (version 3.4.0).

圖 1-2 FuRich 軟件（2.1.2 版本）截圖Fig.1-2. The operation interface of FuRich software (version 2.1.2).異基因分析及功能注釋了進一步研究非小細胞肺癌與正常組織之間差異基因的功能，我們使用

圖 1-3 DAVID（6.8 版本）截圖Fig.1-3. The operation interface of online database DAVID (version 6.8). 蛋白相互作用網絡構建為研究非小細胞肺癌相對正常組織所發(fā)生的分子機理異同，我們通過 ST

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