發(fā)布時間：2020-07-17 04:56

【摘要】：本研究基于LC-Q/TOF MS和自建生物堿類化合物數(shù)據(jù)庫建立快速鑒定博落回中生物堿類化合物的定性分析方法,利用飼喂~(13)C同位素標記前體的方法,對博落回物種中血根堿生源合成途徑進行了探索和驗證,并發(fā)現(xiàn)博落回物種中可能存在血根堿生源合成新旁路。同時基于LC-QQQ MS/MS建立檢測血根堿和白屈菜紅堿生源途徑中21個前體、中間體和終產(chǎn)物的定量分析方法,并對博落回不同器官中的這些代謝物進行代謝輪廓分析。得到以下結(jié)果:1.通過建立的LC-Q/TOF MS定性分析方法,在博落回不同器官中總找到700多個特征離子峰,采用數(shù)據(jù)庫和MS/MS質(zhì)譜裂解規(guī)律鑒定了58個特征離子峰為生物堿,其中30個生物堿通過對照品得以確認,19個生物堿為已報道的血根堿和白屈菜紅堿生源合成途徑中的前體化合物,此外(s)-norlaudanosoline、(s)-6-O-methylnorlaudanosoline、(s)-norreticuline 3個化合物首次在高等植物中發(fā)現(xiàn)。2.采用LC-QQQ MS/MS定量分析方法研究博落回中血根堿和白屈菜紅堿生源合成途徑中的中間代謝產(chǎn)物在不同器官中的量化表征,結(jié)果表明這些中間代謝產(chǎn)物在博落回不同器官中的分布均存在顯著性差異,博落回中主要生物堿為苯并菲啶類生物堿血根堿(SAN)、白屈菜紅堿(CHE)和普洛托品類生物堿原阿片堿(PRO)和別隱品堿(ALL)、其次為四氫小檗堿類生物堿N-methylstylopine(cp14)和N-methylcanadine(cp21)。PRO和ALL分別為SAN和CHE的間接前體,是博落回中累積量最高的生物堿,主要分布在根中,含量最高累積量接近30 mg/g,為花、葉和果實累積量的1.5~2倍。cp14和cp21分別為PRO和ALL生源合成的直接前體,主要累積在花和果實中,最高含量接近5 mg/g。其他中間代謝物累積量雖然相對較低,但在不同器官中的分布同樣存在組織特異性。將這些中間代謝物在博落回不同器官中的組織特異性分布規(guī)律與博落回不同器官的轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)進行整合分析,對挖掘血根堿和白屈菜紅堿生源合成途徑中的功能基因提供重要指導(dǎo)~([119])。此外,本研究首次在高等植物中對(s)-norlaudanosoline、(s)-6-O-methylnorlaudanosoline、(s)-norreticuline進行準確定量分析,結(jié)合本課題關(guān)于博落回基因組、轉(zhuǎn)錄組和酵母異源表達研究認為博落回植物中可能存在(s)-norlaudanosoline—(s)-6-O-methylnorlaudanosoline—(s)-norreticuline—(s)-reticuline的代謝途徑~([119])。3.構(gòu)建了以[ring-~(13)C_6]-tyrosine作為飼喂前體的穩(wěn)定性同位素示蹤方法,根據(jù)~(13)C同位素標記化合物與非同位素標記化合物之間保留時間一致和精確質(zhì)量數(shù)相差6.0204Da的特征篩選出179個~(13)C同位素標記化合物,通過自建生物堿數(shù)據(jù)庫進行比對,鑒定了44個化合物,其中20個13C同位素標記化合物為已報道罌粟中血根堿和白屈菜紅堿生源合成的前體或中間代謝物,通過同位素示蹤酪氨酸在博落回植株中的代謝流,證實了博落回中存在已報道的通過罌粟、花菱草等多物種已確證的血根堿生源合成途徑;另外,根據(jù)~(13)C同位素標記化合物的結(jié)構(gòu)特征和已有生源合成途徑,對博落回血根堿生源合成途徑進行新的演繹和推測,發(fā)現(xiàn)博落回中可能還存在血根堿生源合成新旁路,即從scoulerine—N-methylscoulerine—N-methylcheilanthifoline—N-methylstylopine—protopine。
【學位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R284
【圖文】：

湖南農(nóng)業(yè)大學博士學位論文圖2-2 N-甲基刺罌粟堿（5）、N-甲基四氫小檗堿（6）的化學合成路線圖Figure 2-2 Synthesis of (s)-N-methylstylopine (5) and N-methlycanadine (6)

圖2-2 N-甲基刺罌粟堿（5）、N-甲基四氫小檗堿（6）的化學合成路線圖Figure 2-2 Synthesis of (s)-N-methylstylopine (5) and N-methlycanadine (6)圖2-3烏藥堿（6）和氮甲基烏藥堿（9）的化學合成路線圖Figure 2-3 Synthesis of ((s)-coclaurine (6) and (s)-N-Methylcoclaurine (9)

圖2-6八類異喹啉類生物堿（Ⅰ Ⅷ）Figure 2-6 Eight types of isoquinoline alkaloids (Ⅰ Ⅷ)根據(jù)第一和第二類生物堿的結(jié)構(gòu)可知母離子容易發(fā)生中性丟失丟掉 NH(CH3)2、NH2CH3或 NH3形成 [M-45]+, [M+H-31]+或 [M+H-17]+形式的產(chǎn)物離子。第一類生物堿，骨架易發(fā)生斷裂，產(chǎn)物離子 m/z 大部分小于 200 Da，第二類生物堿由于存苯環(huán)和六元環(huán)的共軛結(jié)構(gòu)，骨架較難斷裂，產(chǎn)物離子多為取代基的丟失而形成，產(chǎn)物離子m/z 大部分大于 200Da[115]；圖 2-9e 為 cp10 標準品的二級質(zhì)譜圖，主要產(chǎn)物離子都小于 200 符合以上特征�；衔� cp50，根據(jù)其在二級質(zhì)譜圖中母離子的精確分子量 m330.1642 ([M]+)(圖 2-9j )，計算分子式為 C19H24NO4+。在二級質(zhì)譜圖中，母離子與產(chǎn)物離子 m/z 285.1055 (C17H17O4+) 之間相差一個中性分子 NH(CH3)2(45 Da)，并且另外兩個主要的碎片離子 m/z 123.0414 和 175.0724 均小于 200 Da(圖 2-9j)。因此，推測化合物 cp50 為第一類生物堿�；衔� cp50 通過 β 裂解形成的產(chǎn)物離子 m/z 123.0414（元素組成為 C7H7O2+），暗示 C 環(huán)上存在 2 個羥基。根據(jù)異喹啉類生物堿的生源合成途徑將羥基定位于 3’和 4’位。α 裂解產(chǎn)生的碎片離子 175.0747 (C11H11O2+) 則表明 A 環(huán)上存

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本文編號：2759006