發(fā)布時間：2020-07-13 04:45

【摘要】：研究背景:骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis OA)又稱退行性骨關(guān)節(jié)病,是最常見的一種關(guān)節(jié)紊亂性疾病,在世界范圍內(nèi)影響著成千上萬的患者,在中老年人群中尤為多見。有報道指出,到2020年,美國骨關(guān)節(jié)炎人口將達到5000萬人,占成年人人口的25%。據(jù)2018年中華骨科雜志發(fā)布的《骨關(guān)節(jié)炎診療指南》統(tǒng)計,我國65歲以上人群50%以上為骨關(guān)節(jié)炎患者,累及的部位包括髖、膝、踝、手及頸腰椎等關(guān)節(jié),我國膝關(guān)節(jié)癥狀性骨關(guān)節(jié)炎患病率達到8.1%,而且隨著我國人口老齡化進展的加速,骨關(guān)節(jié)炎的患病率還有逐漸增高的趨勢,嚴(yán)重影響中老年人的健康與生活質(zhì)量,給我國國民經(jīng)濟和社會發(fā)展帶來了巨大負(fù)擔(dān)。骨關(guān)節(jié)炎病變主要是在生物學(xué)與力學(xué)因素共同作用下破壞軟骨細胞、細胞外基質(zhì)以及軟骨下骨合成與降解的平衡,導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退變纖維化、軟骨下骨硬化、周圍骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)間隙變窄以及滑膜炎等,其中最重要環(huán)節(jié)是關(guān)節(jié)軟骨的退變。許多研究證實IL-1β能夠阻斷軟骨細胞在ECM成分中合成,干擾關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白的合成,如Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白多糖。軟骨細胞受到IL-1β刺激后,往往迅速衰老或逐漸凋亡,可以觀察到IL-1β對軟骨有多方面影響,包括抑制其修復(fù)的可能性、通過酶加速軟骨退化和直接對軟骨細胞產(chǎn)生副作用,因此IL-1β被廣泛應(yīng)用作為誘導(dǎo)軟骨細胞炎癥反應(yīng)的體外模型�；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類酶活性依賴于鋅離子的中性蛋白酶超家族。在關(guān)節(jié)軟骨破壞中起重要作用的主要是MMP-3、MMP-9和MMP-13,它們主要是由軟骨細胞、滑膜細胞、炎性細胞和巨噬細胞分泌,它們均參與了破壞軟骨基質(zhì),致使膠原暴露于破壞膠原的酶并激活酶的活性,導(dǎo)致膠原的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞,最后使其破裂分解。Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅱ)和聚蛋白多糖(Aggrecan)是軟骨基質(zhì)中主要成分,其表達和凋亡可以作為反應(yīng)軟骨退變程度的指標(biāo),其活性的降低將導(dǎo)致ECM再生紊亂,最終導(dǎo)致軟骨退化。SDF-1是由滑膜產(chǎn)生,而CXCR4主要由關(guān)節(jié)軟骨表達。最近的研究明確表明SDF-1/CXCR4信號在OA的病變過程中也起著至關(guān)重要的作用。體外研究表明,SDF1和CXCR4相互作用是通過上調(diào)MMPs表達刺激了人類軟骨細胞的分解代謝活動。有實驗表明在OA患者滑液中的SDF-1水平出現(xiàn)升高,但可以通過滑膜切除手術(shù)減少其表達,這進一步證實了 SDF-1/CXCR4參與了 OA的進展,也有學(xué)者通過基因操作或藥理阻斷下調(diào)SDF-1/CXCR4表達,在體外能強有力的減弱人軟骨細胞的ECM退化,并能改善動物模型中OA,這些研究結(jié)果表明,SDF-1是通過刺激MMPs表達來影響軟骨細胞和基質(zhì)改變的,從而提出抑制SDF-1/CXCR4信號通路是一個治療OA潛在藥物作用靶點。臨床上OA的早期治療以基礎(chǔ)治療和藥物治療為主,雖然可以減輕疼痛、緩解部分癥狀,但尚不能延緩疾病的進展,且口服藥物還存在不可忽視的副作用,如潛在的損害消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)風(fēng)險等。雖然人工關(guān)節(jié)置換術(shù)作為一種可以真正阻斷OA進展達到臨床治愈的措施,但由于人工關(guān)節(jié)材料磨損、價格昂貴以及手術(shù)風(fēng)險等并發(fā)癥的存在,其目前主要適用于癥狀嚴(yán)重的晚期OA患者。對于早、中期OA患者,仍然缺乏有效干預(yù)疾病進展的方式。因此,深入研究骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)發(fā)病機制和治療方法有著十分重要的現(xiàn)實意義及價值。雷公藤紅素是一種從雷公藤根部提取的醌甲基三萜化合物,因抗癌和抗炎作用受到廣泛關(guān)注。以前的報告清楚地證實了雷公藤紅素能夠調(diào)節(jié)各種轉(zhuǎn)錄因子、信號通路、粘附分子、細胞因子和趨化因子,包括CXCR4。與雷公藤紅素在癌癥和炎癥中的有益作用一致,在實驗室和臨床中都能觀察到雷公藤紅素對不同形式的關(guān)節(jié)炎具有強有力的療效。在之前的報道中,Yadav等人在實驗中發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素具有通過下調(diào)CXCR4的表達來抑制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的潛力。同樣,雷公藤紅素在缺氧條件下通過抑制CXCR4抑制成纖維細胞樣滑膜細胞(FLSs)的遷移和侵襲,從而改善RA。其他報道也揭示了雷公藤紅素對MMPs和炎性細胞因子的抑制作用,這些都可能參與關(guān)節(jié)炎的病理過程�？傊�,這些結(jié)果為雷公藤紅素治療RA患者提供了機制上的依據(jù),然而,關(guān)于雷公藤紅素在OA病理過程中具體調(diào)節(jié)功能的數(shù)據(jù)有限�？紤]到SDF-1/CXCR4在OA進展中的關(guān)鍵作用,我們有理由推測雷公藤紅素作為一種影響SDF-1/CXCR4的中草藥產(chǎn)品,在OA治療中具有顯著的療效及無限的應(yīng)用潛力。因此我們有必要進行了一些相關(guān)實驗來探討雷公藤紅素在OA中的作用及機制。第一部分雷公藤紅素抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的炎癥反應(yīng)及分解代謝目的:觀察雷公藤紅素對體外培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的毒性作用;觀察雷公藤紅素拮抗IL-1β介導(dǎo)的軟骨細胞炎癥反應(yīng)及分解代謝作用。方法:取4周齡SD大鼠股骨頭關(guān)節(jié)軟骨細胞體外分離培養(yǎng)傳至第3代,并用番紅O染色及Ⅱ型膠原熒光免疫熒光法進行軟骨細胞的鑒定;雷公藤紅素處理大鼠軟骨細胞后,用細胞計數(shù)活性法(CCK-8)檢測雷公藤紅素對軟骨細胞活性的影響;用雷公藤紅素干預(yù)IL-1β(10ng/ml)刺激的軟骨細胞,用實時定量PCR法檢測細胞內(nèi)MMP-13、ADAMTS-5基因的表達變化,并提取細胞蛋白,采用Western blot法檢測軟骨細胞中MMP-13、ADAMTS-5表達變化,從蛋白水平進一步驗證;收集軟骨細胞上清液,采用ELISA法檢測炎性因子COX-2及iNOS的濃度變化。用雷公藤紅素處理大鼠軟骨細胞,采用實時定量PCR法檢測細胞內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白和Aggrecan基因的表達。結(jié)果:1.成功分離并培養(yǎng)大鼠軟骨細胞,經(jīng)番紅O染色及Ⅱ型膠原免疫熒光鑒定提取的細胞為軟骨細胞。2.通過CCK8檢測發(fā)現(xiàn):雷公藤紅素在0.2μM-1.2μM濃度范圍內(nèi),對軟骨細胞無明顯毒性作用;其中0.8μM濃度的雷公藤紅素對軟骨細胞的活性較好。3.雷公藤紅素抑制MMP-13和ADAMTS-5表達,同時抑制炎癥因子COX-2和iNOS表達。4.雷公藤紅素可以促進Ⅱ型膠原蛋白和Aggrecan的基因表達。結(jié)論:1.雷公藤紅素在0.2μM-1.2μM濃度范圍內(nèi),對軟骨細胞無明顯毒性作用;0.8μM濃度的雷公藤紅素對軟骨細胞的活性較好。2.雷公藤紅素對OA軟骨細胞具有抗炎抗降解的作用;雷公藤紅素可以在一定程度上促進軟骨細胞外基質(zhì)修復(fù)作用。第二部分雷公藤紅素延緩大鼠骨關(guān)節(jié)炎進展目的:以單碘乙酸鹽(MIA)誘導(dǎo)的大鼠OA模型為研究對象,觀察雷公藤紅素治療OA前后,大鼠關(guān)節(jié)疼痛和軟骨損傷的變化;探討雷公藤紅素在大鼠OA中對MMPs、COMP fragment、Ⅱ 型膠原蛋白、Aggrecan 的影響。方法:24只重約200-220g的SD大鼠隨機分為4組,Sham組、OA組、雷公藤紅素低劑量組、雷公藤紅素高劑量組,每組6只,我們采用MIA誘導(dǎo)OA大鼠模型;在造模后的第二天關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射不同劑量的雷公藤紅素,連續(xù)注射14天,在第0、7、14天通過行走距離、站立次數(shù)、后爪重量分布的變化來評估造模前后及治療前后大鼠骨關(guān)節(jié)炎疼痛的變化;并采用實時定量PCR檢測疼痛基因CCR-2和MCP-1表達變化;在治療后第14天取股骨髁膝關(guān)節(jié)標(biāo)本,并用福爾馬林固定后進行脫鈣、脫水及蠟塊制作,制片成功后使用番紅O染色并采用OOCHAS評分系統(tǒng)觀察關(guān)節(jié)軟骨的改變;對大鼠血清中的COMP fragment進行Elisa檢測,并在組織切片進行了 COMP fragment的免疫組化染色,觀察雷公藤紅素是否可以抑制COMP降解;應(yīng)用免疫組化檢測MMP-13表達變化,并采用Western blot法檢測不同劑量的雷公藤紅素對MIA誘導(dǎo)的OA大鼠模型中MMP-3、MMP-9、MMP-13、Ⅱ型膠原蛋白和Aggrecan的表達情況;結(jié)果:1.大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA后,OA組較Sham組的行走距離、站立次數(shù)明顯減少,后爪重量分布顯著減少(P0.01);注射雷公藤紅素組與OA組相比,在第7天和14天觀察雷公藤紅素組的行走距離、站立次數(shù)明顯增多,后爪重量分布明顯升高(P0.01);疼痛基因CCR-2和MCP-1的表達雷公藤紅素治療組明顯低于OA組(P0.01),且具有劑量依賴性。2.軟骨組織番紅O染色:Sham組關(guān)節(jié)軟骨的番紅O染色無明顯減退,潮線完整;軟骨細胞數(shù)量及排列正常;蛋白多糖(PG)含量正常;OA組關(guān)節(jié)可見軟骨細胞數(shù)量明顯減少,局部細胞排列紊亂不規(guī)則,蛋白多糖(PG)含量明顯減少;雷公藤紅素注射組可見局部軟骨細胞明顯增多,排列較整齊,蛋白多糖(PG)含量明顯增加。OA組的OOCHAS評分明顯高于正常組,而雷公藤紅素組的OOCHAS評分明顯比OA組低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。3.雷公藤紅素治療組大鼠關(guān)節(jié)炎模型中血清COMP fragment濃度低于OA組。4.組織切片進行免疫組化染色,結(jié)果顯示雷公藤紅素治療組COMP fragment、MMP-13 均少于 OA 組。5.雷公藤紅素能明顯抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13的表達,且雷公藤紅素高劑量組(2mg/kg)較低劑量組(1mg/kg)抑制效果更明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Cell:P0.01,Ce12:P0.05,與 OA 組相比)。6.雷公藤紅素能夠上調(diào)Ⅱ型膠原蛋白、Aggrecan的蛋白表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Cell:P0.01,Ce12:P0.05,與OA組相比),且有劑量依懶性。結(jié)論:雷公藤紅素能夠減輕大鼠OA疼痛癥狀及軟骨損傷,抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13的表達,上調(diào)Ⅱ型膠原蛋白、Aggrecan的蛋白表達,減輕軟骨細胞外基質(zhì)降解,從而延緩大鼠OA進展。第三部分:雷公藤紅素抗骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)機制的體內(nèi)及體外實驗研究目的:探討雷公藤紅素對OA動物模型和IL-1 β介導(dǎo)的軟骨細胞抗炎抗降解作用的分子機制。方法:我們體內(nèi)實驗以MIA誘導(dǎo)的大鼠OA為研究對象,采用Western blot方法檢測Sham組、OA組以及不同劑量雷公藤紅素組中SDF-1和CXCR4表達水平;體外實驗為取4周齡SD大鼠股骨頭關(guān)節(jié)軟骨細胞體外分離培養(yǎng)傳至第3代,加入不同濃度的雷公藤紅素干預(yù),用IL-1β(1Ong/ml)刺激的軟骨細胞,用PCR法檢測不同濃度雷公藤紅素干預(yù)后軟骨細胞中CXCR4表達水平變化;通過慢病毒轉(zhuǎn)染使軟骨細胞中CXCR4過表達,用PCR法檢測ECM降解酶MMP-13和ADAMTS-5的信使RNA水平的變化。結(jié)果:1.雷公藤紅素抑制OA大鼠模型軟骨組織中SDF-1和CXCR4的表達,且雷公藤紅素高劑量組較低劑量組抑制作用更明顯;2.雷公藤紅素抑制IL-1β刺激的軟骨細胞中CXCR4的基因表達,其濃度越高,雷公藤紅素抑制CXCR4作用越明顯。3.通過慢病毒轉(zhuǎn)染使軟骨細胞過表達CXCR4基因,結(jié)果顯示:1)在CXCR4正常表達的前提下,經(jīng)雷公藤紅素干預(yù)后,軟骨細胞中MMP-13和ADAMTS-5的表達較未干預(yù)組明顯降低;2)在同等劑量雷公藤紅素干預(yù)的前提下,在過表達CXCR4基因組中雷公藤紅抑制MMP-13和ADAMTS-5基因的能力較CXCR4基因正常表達組明顯減弱;3)在不經(jīng)雷公藤紅素干預(yù)的前提下,過表達CXCR4基因組中,MMP-13和ADAMTS-5表達較CXCR4基因正常表達組明顯升高。結(jié)論:1.雷公藤紅素能夠抑制大鼠OA模型中SDF-1和CXCR4的表達,且存在劑量依賴性;2.雷公藤紅素能夠抑制IL-1β介導(dǎo)的軟骨細胞中CXCR4的表達,且存在濃度依賴性;3.雷公藤紅素可通過抑制SDF-1/CXCR4信號通路來降低MMP-13和ADAMTS-5的表達水平。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

２）．番紅Ｏ染色鑒定軟骨細胞逡逑番紅０是堿性染料可與核酸結(jié)合顯示紅色，染色后我們可以看到細胞核粉紅色（見圖３）。逡逑圖３：軟骨細胞番紅０染色（ｘ２００）逡逑３）邋．１１型膠原免疫熒光法鑒定逡逑ＩＩ型膠原是軟骨細胞分泌的特異性膠原，可利用ＩＩ型膠原的免疫熒光對軟逡逑骨細胞進行鑒定。熒光標(biāo)記后，軟骨細胞胞質(zhì)ＩＩ型膠原表達陽性，呈紅褐色熒逡逑光，細胞核不著色，為藍色熒光，激光共聚焦顯微鏡下軟骨細胞形態(tài)清晰可見。逡逑３３逡逑

圖２：原代軟骨細胞（ｘ４０）逡逑２）．番紅Ｏ染色鑒定軟骨細胞逡逑

圖６：為圖４和圖５的重疊，胞質(zhì)為紅褐色熒光，胞核為藍色熒光，細胞形態(tài)清晰２．雷么Ｖ藤紅素對軟骨細胞活性無影響逡逑我們采用經(jīng)典的ＣＣＫ８法，探索不同濃度的雷公藤紅素對大鼠軟骨細胞的影響，參考既往的研究文獻，我們選取的濃度范圍為0．２ｈＭ邋－１．２ｎＭ。實驗結(jié)逡逑果表明在０．２＾Ｍ邋－１．２ＭＭ濃度范圍內(nèi)的雷公藤紅素對大鼠軟骨細胞無明顯毒性及逡逑抑制作用，各濃度孔與對照孔相比無統(tǒng)計學(xué)差異（Ｐ＞ａ0５）。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)０．８ｆｉＭ逡逑濃度的雷公藤紅素對軟骨細胞的活性較好，因此后續(xù)實驗我們選擇了邋０．８ｐＭ組逡逑（見圖７）。逡逑３４逡逑

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 江靜;楊臣;;不同部位、來源雷公藤藥材的雷公藤紅素含量比較[J];亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥;2019年05期

2 楊煬;陽勇;秦偉瀚;張小梅;楊大堅;郭延壘;;雷公藤紅素在小鼠血漿中的代謝研究[J];重慶中草藥研究;2018年01期

3 張登海;;雷公藤紅素研究的現(xiàn)狀和展望[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2018年03期

4 常英梅;;雷公藤的藥理基礎(chǔ)及其制劑的進展[J];臨床醫(yī)藥文獻電子雜志;2018年14期

5 柳笑彥;;雷公藤紅素對小鼠腹腔巨噬細胞極化分型的影響[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2018年05期

6 張杰,廖啟順,王蘭瓊;國內(nèi)雷公藤紅素藥理作用及臨床運用研究概況[J];中國民族民間醫(yī)藥雜志;2005年03期

7 張羅修,徐維敏,曹致芳,梅美珍,易鴻匹;雷公藤紅素對巨噬級胞合成及釋放前列腺素E_2及吞噬功能的影響[J];中藥藥理與臨床;1988年02期

8 許月林;康克非;;雷公藤研究進展[J];上海醫(yī)學(xué);1988年03期

9 嚴(yán)云屏,施守義,施宜平,張照寰,潘德濟;雷公藤紅素外用治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎局部腫痛[J];新藥與臨床;1989年06期

10 施昌年;雷公藤藥理作用的研究進展[J];中國醫(yī)院藥學(xué)雜志;1989年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 董一珠;張冰;林志健;張曉朦;;基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討雷公藤紅素致心臟毒性作用機制[A];第二屆臨床中藥學(xué)大會論文集[C];2018年

2 朱影;郭勇;;雷公藤紅素抗惡性腫瘤機制的研究進展[A];第十五屆全國中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學(xué)術(shù)大會論文集[C];2017年

3 韓曉曦;趙名;于曉Y

本文編號：2752979