【摘要】：目的:黃柏是一種常用中藥,在我國分布廣泛、資源豐富,在《中國藥典》中黃柏的活性成分檢測(cè)包括小檗堿和黃柏堿,但是在工業(yè)生產(chǎn)上黃柏常常作為提取小檗堿的主要原料,而含有黃柏堿的工業(yè)廢水排放到環(huán)境中造成了大量的浪費(fèi)和污染。本課題主要是模擬工業(yè)生產(chǎn)對(duì)黃柏提取小檗堿后的廢液進(jìn)行黃柏堿的回收提取工藝研究,并且對(duì)黃柏堿進(jìn)行了系統(tǒng)的抗氧化活性及其相關(guān)機(jī)制研究,其意義在于加強(qiáng)黃柏資源的合理利用以及環(huán)境保護(hù)作用,同時(shí)為黃柏堿的臨床開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法和結(jié)果:(1)本研究采用工業(yè)上常用的大孔樹脂進(jìn)行黃柏堿進(jìn)行富集,然后采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化,整個(gè)過程使用TLC鑒別和HPLC進(jìn)行含量和純度的分析。結(jié)果顯示,流出液的體積在5.5BV時(shí)黃柏堿開始出現(xiàn)滲漏,因此最大上樣量為5BV;黃柏堿通過大孔樹脂富集回收后的純度約為70%,回收率為71.76%;反相硅膠柱層析采用甲醇-水梯度洗脫,用60%的甲醇加少量濃氨水能夠迅速將大部分黃柏堿洗脫下來,減壓濃縮后加一定量的甲醇置4℃冰箱中結(jié)晶,經(jīng)HPLC分析純化后的黃柏堿純度可達(dá)到90%,將此結(jié)晶加少量濃鹽酸溶解后再加適量甲醇進(jìn)行重結(jié)晶可得純度為98%以上的黃柏堿單體,最后的整體回收率約35.59%。(2)黃柏堿進(jìn)行體外抗氧化活性分析主要采用了化學(xué)分析法以及熒光分光光度法。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)黃柏堿有較好的清除ABTS+、DPPH自由基、O2.-的作用,并且在相同濃度下黃柏堿清除DPPH的能力比小檗堿強(qiáng);本實(shí)驗(yàn)還利用A549細(xì)胞模型評(píng)價(jià)了黃柏堿清除ROS的能力,結(jié)果顯示黃柏堿的濃度為5、25μg/ml時(shí)在細(xì)胞中有顯著的清除ROS的作用。(3)以斑馬魚胚胎為模型對(duì)黃柏堿進(jìn)行體內(nèi)抗氧化活性分析,主要采用DCFH-DA、DPPP、AO熒光染料處理后再用熒光顯微鏡拍照并分析熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示不同濃度的黃柏堿對(duì)由AAPH引起的斑馬魚胚胎死亡以及心跳異常等現(xiàn)象均有較好的保護(hù)效果,特別是200μg/ml的黃柏堿能夠在72h時(shí)將斑馬魚胚胎的存活率提高到90.26±1.40%;此外,黃柏堿在斑馬魚體內(nèi)還具有較好的清除ROS,降低脂質(zhì)過氧化以及細(xì)胞死亡率的效果,特別是在清除ROS方面呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。(4)分別以斑馬魚胚胎和A549細(xì)胞為模型對(duì)黃柏堿的抗氧化機(jī)制進(jìn)行研究,主要使用了RT-PCR以及蛋白免疫印跡法分別對(duì)抗氧化通路上的關(guān)鍵基因和蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,在斑馬魚體內(nèi)100μg/ml的黃柏堿能夠顯著提高AKT、Nrf2、HO-1和Bcl-2基因的表達(dá)而對(duì)NF-κB和P53基因具有下調(diào)的作用;通過WB分析發(fā)現(xiàn)黃柏堿能夠抑制AKT以及NF-κB的磷酸化作用,加入通路抑制劑LY294002和BAY11-7082后能夠顯著抑制AKT和NF-κB對(duì)應(yīng)的下游蛋白的表達(dá),而黃柏堿與此有相同的作用。結(jié)論:在對(duì)黃柏堿的回收提取過程中主要采用了醫(yī)藥工業(yè)上常用的大孔樹脂和C18硅膠填料,在洗脫劑方面主要使用的是乙醇、甲醇和水,它們廉價(jià)易得且回收方便對(duì)環(huán)境污染少。此外研究顯示黃柏堿在體內(nèi)外均具有較好的抗氧化作用,體外抗氧化活性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)黃柏堿清除DPPH自由基的效果比小檗堿強(qiáng)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)黃柏堿在斑馬魚胚胎體內(nèi)主要是激發(fā)了AKT/Nrf2/HO-1這一關(guān)鍵性的抗氧化防御系統(tǒng),從而達(dá)到清除ROS的作用,提高了胚胎的存活率。由于NF-κB不僅與氧化應(yīng)激相關(guān)而且還是炎癥反應(yīng)的重要通路,因此在A549細(xì)胞中對(duì)這一通路進(jìn)行了深入研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃柏堿能夠抑制ROS引起的炎癥通路上相關(guān)蛋白的表達(dá)主要是通過抑制IKK/NF-κB通路來實(shí)現(xiàn)的,同時(shí)它還能夠顯著降低NF-κB的下游蛋白COX-2的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

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6 祝晨

本文編號(hào)：2750738