發(fā)布時(shí)間：2020-07-06 08:55

【摘要】：一、研究背景與目的桑辛素是從桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮、樹(shù)枝及桑葚中提取分離出的一種異戊烯基黃酮類(lèi)化合物,具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗驚厥及抗炎等一系列的藥理活性。2015年桑辛素被確定為全球首個(gè)純天然抗HIV植物藥復(fù)方SH中的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控成分。復(fù)方SH,又稱(chēng)“司艾特散”,是從20多種活性較強(qiáng)的中草藥中選擇了5味中藥,按“君,臣,佐,使”的配伍原則,組方而成。對(duì)HIV的治療有效率高達(dá)89%,可供HIV感染者長(zhǎng)期服用,并于2012年8月正式獲準(zhǔn)在泰國(guó)銷(xiāo)售。成為我國(guó)第一個(gè)在國(guó)外獲得新藥證書(shū)并上市的純天然抗HIV植物藥,開(kāi)創(chuàng)了中草藥治療HIV的先河。桑辛素作為復(fù)方SH中“君藥”桑白皮的主要藥效成分,推測(cè)其在抗HIV病毒方面也可能具有卓越的藥效,目前尚無(wú)有關(guān)桑辛素抗病毒藥效方面的報(bào)道。另一方面,桑辛素為5,2',4'-三羥基黃酮,分子中具有多個(gè)游離的酚羥基,極易受葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶催化發(fā)生II相結(jié)合反應(yīng),該類(lèi)反應(yīng)也是黃酮類(lèi)化合物的主要代謝途徑。目前,有關(guān)桑辛素的代謝機(jī)制缺乏深入的研究,之前的研究?jī)H對(duì)桑辛素的CYP代謝進(jìn)行了簡(jiǎn)要研究,對(duì)其葡萄糖醛酸化代謝尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。盡管已有LC-MS/MS方法應(yīng)用于血漿中桑辛素的測(cè)定,但是其代謝物在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)尚無(wú)研究報(bào)道。充分了解藥物的體內(nèi)處置過(guò)程對(duì)于闡明藥物的藥效作用和顯效機(jī)制具有重要的意義。因此,本課題:(1)首先對(duì)桑辛素本身的抗HIV藥效進(jìn)行了研究,確定其藥理活性,為其成為新的抗HIV治療藥物的成藥性研究提供必要的研究基礎(chǔ)。(2)系統(tǒng)研究桑辛素的代謝機(jī)制及其藥代動(dòng)力學(xué)特征,闡明其在體內(nèi)的主要暴露形式和水平,有利于預(yù)測(cè)藥物的療效和潛在的毒性反應(yīng),對(duì)其藥物成藥性發(fā)展和臨床應(yīng)用具有十分重要的意義。此外,目前HIV在臨床上的治療方法通常為多種藥物聯(lián)合使用的雞尾酒療法(HAART療法),但長(zhǎng)期服用會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副反應(yīng),并且導(dǎo)致大量耐藥毒株出現(xiàn)。中藥治療HIV具有作用平和而持久、提高機(jī)體免疫功能、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性、價(jià)格便宜、適合國(guó)情、患者依從性好、能夠長(zhǎng)期服用等特點(diǎn)。因此,采用中西藥的聯(lián)合療法治療HIV已經(jīng)成為新的治療趨勢(shì),具有廣闊的發(fā)展前景。桑辛素作為潛在的抗HIV天然產(chǎn)物,當(dāng)它與其他化學(xué)藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí),由于其在體內(nèi)具有廣泛的代謝,必須考慮代謝相關(guān)的藥物相互作用。從而有助于優(yōu)化給藥劑量和避免毒副作用,為臨床用藥的安全和有效性提供重要的理論依據(jù)。在本論文中,我們采取了體內(nèi)、體外和在體多種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)桑辛素的代謝機(jī)理及基于代謝的藥藥相互作用進(jìn)行了深入研究。首先,我們采用TZM-bl細(xì)胞研究了桑辛素對(duì)HIV-1SF162感染的抑制活性,并以臨床上常用的抗HIV化學(xué)藥物替諾福韋作為陽(yáng)性對(duì)照,考察方法的可靠性,并與桑辛素的抗HIV活性作對(duì)比。接著,采用大鼠在體腸灌流模型研究了桑辛素在大鼠腸道的吸收與代謝特征,并收集膽汁了解藥物的排泄情況。采用重組人源化CYP純酶,UGT純酶以及特異性化學(xué)抑制劑對(duì)桑辛素進(jìn)行體外代謝孵育,確定參與其代謝反應(yīng)的主要酶亞型。通過(guò)研究桑辛素在人肝微粒體,鼠肝微粒體及主要代謝酶中的酶代動(dòng)力學(xué)特征,闡明桑辛素的代謝機(jī)理。最后,建立了一個(gè)同時(shí)檢測(cè)桑辛素原型和主要代謝產(chǎn)物的快速靈敏的LC-MS/MS方法。運(yùn)用此方法,考察了桑辛素口服給藥SD大鼠藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn),闡明桑辛素口服后在體內(nèi)的主要暴露形式和水平。同時(shí)考察桑辛素與抗HIV化學(xué)藥物聯(lián)合使用時(shí)的藥藥相互作用。研究當(dāng)藥物聯(lián)用時(shí),與各藥物單獨(dú)給藥時(shí)相比,血漿藥物濃度-時(shí)間曲線與主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化。二、實(shí)驗(yàn)方法1.桑辛素體外抗HIV藥效研究采用TZM-bl細(xì)胞,考察桑辛素對(duì)HIV-1SF162感染的抑制活性,計(jì)算藥物對(duì)病毒的抑制率。并以抗HIV化學(xué)藥物替諾福韋作為陽(yáng)性對(duì)照。2.桑辛素在大鼠腸道的吸收與代謝研究采用大鼠在體腸灌流模型,收集腸道灌流液和膽汁樣品,分析桑辛素在大鼠腸道中的吸收與代謝特點(diǎn)。并將桑辛素與人腸微粒體和制備的大鼠各腸段微粒體共同孵育,研究桑辛素在腸道的代謝特征。3.桑辛素的體外代謝機(jī)理研究采用9種重組人源化CYP純酶,12種UGT純酶以及特異性化學(xué)抑制劑對(duì)桑辛素進(jìn)行體外代謝孵育,研究介導(dǎo)桑辛素代謝的主要酶亞型。比較桑辛素在人肝微粒體,鼠肝微粒體及主要代謝酶中的酶代動(dòng)力學(xué)參數(shù),闡明桑辛素的代謝機(jī)理。4.桑辛素的藥代動(dòng)力學(xué)研究采用SD大鼠藥代動(dòng)力學(xué)模型,研究桑辛素灌胃給藥大鼠后(8mg/kg和16 mg/kg)的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。以LC-MS/MS檢測(cè)大鼠血漿中的桑辛素及其主要代謝物的含量,繪制相應(yīng)的藥時(shí)曲線,用WinNonlin(?)3.3非房室模型計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。5.桑辛素與抗HIV化藥的藥藥相互作用采用SD大鼠藥代動(dòng)力學(xué)模型,給大鼠灌胃給藥2種藥物(桑辛素和抗HIV化學(xué)藥物),測(cè)定血漿中藥物及代謝物的濃度。研究當(dāng)2種藥物聯(lián)合給藥時(shí),與各藥物單獨(dú)給藥組相比,藥時(shí)曲線與主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.桑辛素體外抗HIV藥效研究桑辛素對(duì)HIV-1SF162感染具有顯著的抑制活性,其IC50=5.27μM。作為陽(yáng)性對(duì)照組的替諾福韋,IC50 = 2.64 μM。2.桑辛素代謝產(chǎn)物的鑒定通過(guò)UPLC-MS/MS質(zhì)譜分析結(jié)合紫外光譜峰偏移法,鑒定了 4個(gè)桑辛素Ⅱ相代謝產(chǎn)物(M-5-G,MⅡ-2,M-4'-G和M-2'-G)及2個(gè)I相代謝產(chǎn)物(MⅠ-1和MⅠ-2)。3.桑辛素在大鼠腸道中的吸收和代謝通過(guò)大鼠在體腸灌流實(shí)驗(yàn),表明十二指腸和空腸是桑辛素在腸道的主要吸收和代謝部位,吸收方式為被動(dòng)擴(kuò)散。M-4'-G是桑辛素在腸道生成的最主要的代謝物。4.桑辛素的CYP和UGT代謝機(jī)理研究通過(guò)化學(xué)抑制劑和重組人源化純酶實(shí)驗(yàn),表明在桑辛素的CYP代謝中,CYP3A4,3A5和2C19是最重要的代謝酶,其次是CYP2B6,2C9,2D6和1A2,CYP2C8和2E1幾乎不參與桑辛素的CYP代謝。在桑辛素的葡萄糖醛酸化代謝中,UGT1A1,1A3,1A7和2B7是介導(dǎo)反應(yīng)的主要酶亞型。5.桑辛素在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究本課題建立了可同時(shí)檢測(cè)大鼠血漿中桑辛素原型及4種代謝物的靈敏、可靠的UPLC-MS/MS定量分析方法�？诜o藥后(8和16mg/kg),桑辛素在大鼠胃腸道中迅速吸收入血并被轉(zhuǎn)化為4種代謝產(chǎn)物,包括3個(gè)單葡萄糖醛酸苷和1個(gè)羥基化代謝產(chǎn)物,即M-5-G,MⅡ-2,M-4'-G和MⅠ-t。桑辛素原型在大約30~40min左右達(dá)峰并在48h完全消除,Cmax和AUC0-t分別為299.12 ±119.52 ng/mL和98.32 ± 21.13 min·μg/mL(16 mg/kg組)。代謝物中,M-4'-G的血藥濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它3個(gè)代謝物,AUC0-t是其它代謝物的10倍以上,是桑辛素在體內(nèi)最主要的代謝產(chǎn)物。M-5-G,M-4'-G和MⅠ-1的藥時(shí)曲線趨勢(shì)一致,均在60 min內(nèi)達(dá)峰,隨后逐漸消除。但MⅡ-2的藥時(shí)曲線明顯不同,達(dá)峰時(shí)間很晚(672~800 min),導(dǎo)致MⅡ-2消除時(shí)間和在體內(nèi)的滯留時(shí)間均較長(zhǎng),在給藥后36 h的血漿中仍可檢測(cè)到。兩個(gè)給藥劑量組的桑辛素原型和代謝物均存在明顯的雙峰現(xiàn)象,推測(cè)可能是由于存在肝腸循環(huán)導(dǎo)致的。6.桑辛素與抗HIV化藥的藥藥相互作用本章考察了桑辛素與抗HIV化藥一起口服后,對(duì)桑辛素以及抗HIV化藥各自的藥代動(dòng)力學(xué)特征的影響。首先,我們考察了阿扎那韋硫酸鹽對(duì)桑辛素藥動(dòng)學(xué)特征的影響。結(jié)果表明:當(dāng)桑辛素與阿扎那韋硫酸鹽聯(lián)合給藥時(shí),阿扎那韋硫酸鹽會(huì)顯著影響桑辛素的藥動(dòng)學(xué)特征,導(dǎo)致桑辛素的Cmax和AUCo-t顯著增高,增加至1.54倍。各代謝物的Cmax也顯著增加,增加至1.4~2倍。隨后,我們又考察了桑辛素對(duì)抗HIV化學(xué)藥物阿扎那韋硫酸鹽和依法韋侖的藥動(dòng)學(xué)行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),桑辛素對(duì)阿扎那韋硫酸鹽藥動(dòng)學(xué)影響較小,僅發(fā)現(xiàn)阿扎那韋的Cmax增高至1.32倍,其余藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無(wú)明顯改變。但是當(dāng)桑辛素與依法韋侖聯(lián)用時(shí),會(huì)產(chǎn)生明顯的藥-藥相互作用,使依法韋侖的Cmax和AUCo-t分別增加至2.22和1.62倍,MRTO-t也顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四、結(jié)論1.本研究首次考察了桑辛素本身的抗HIV藥效,發(fā)現(xiàn)桑辛素對(duì)HIV-1SF162感染具有顯著的抑制活性,IC5O= 5.27 μM,并且對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性作用。提示桑辛素可能成為一個(gè)潛在的抗HIV天然產(chǎn)物候選單體,具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。2.在本實(shí)驗(yàn)中,我們采用了體外、在體和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)聯(lián)合的方法研究桑辛素的代謝機(jī)理和藥代動(dòng)力學(xué)特征,并發(fā)現(xiàn)各數(shù)據(jù)有良好的相關(guān)性。桑辛素口服后在體內(nèi)能迅速轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物,血漿中除了原型藥物外,還含有3個(gè)單葡萄糖醛酸苷(M-5-G,MII-,M-4'-G)和1個(gè)羥基化代謝產(chǎn)物(MI-1),其中M-4'-G是最主要的代謝產(chǎn)物。桑辛素的葡萄糖醛酸化代謝主要是由UGT1A1,1A3,1A7和2B7介導(dǎo),CYP代謝主要由CYP3A4,3A5和2C19介導(dǎo)。全面的代謝機(jī)理和藥動(dòng)學(xué)考察或?qū)ιＰ了氐捏w內(nèi)藥效研究提供新的視角和理論依據(jù),可為其提高生物利用度提供新的思路和方法。3.通過(guò)考察桑辛素與抗HIV化藥聯(lián)合給藥時(shí)的藥藥相互作用,我們發(fā)現(xiàn)阿扎那韋硫酸鹽可顯著影響桑辛素的藥動(dòng)學(xué)行為,使桑辛素的Cmax和AUC0-t增加至1.5倍,各代謝物的Cmax和AUC0-t也呈增高現(xiàn)象。而桑辛素對(duì)阿扎那韋硫酸鹽的藥動(dòng)學(xué)影響較小,僅發(fā)現(xiàn)阿扎那韋的Cmax增高至1.32倍。但是當(dāng)桑辛素與依法韋侖聯(lián)用時(shí),會(huì)產(chǎn)生明顯的藥-藥相互作用,使依法韋倫的Cmax和AUC0-t分別增加至2.22和1.62倍。這些結(jié)果表明當(dāng)桑辛素作為新的抗HIV天然產(chǎn)物在臨床上與阿扎那韋硫酸鹽或依法韋倫合用時(shí),會(huì)發(fā)生明顯的藥-藥相互作用,提高藥物的血藥濃度,增強(qiáng)藥效。應(yīng)注意調(diào)整臨床給藥劑量,避免毒副作用的產(chǎn)生。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285
【圖文】：

是從桑科植物桑Ｌ．的干燥根皮、樹(shù)枝及桑葚中提烯基黃酮類(lèi)化合物［１，２］，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖１－１，為５，２＇，邋４１－三羥［３］、抗菌［４］、抗氧化、鎮(zhèn)痛［５］、抗驚厥及抗炎等一系列的藥理活理學(xué)研宄表明，桑辛素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作頸癌［９］、乳腺癌［１（），１１］、前列腺癌［１２］、肝癌［１３］及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤抗腫瘤活性外，桑辛素還被確定為全球首個(gè)純天然抗ＨＩＶ植標(biāo)準(zhǔn)成分［１７］，推測(cè)其在抗ＨＩＶ病毒方面也可能具有卓越的化合物作為一類(lèi)在自然界中廣泛分布的多酚類(lèi)物質(zhì)，體內(nèi)化合物具有顯著的藥效，然而開(kāi)發(fā)成治療藥物或預(yù)防藥物少，主要原因是黃酮類(lèi)化合物在體內(nèi)可發(fā)生廣泛的Ｉ相和ＩＩ物利用度較低（＜邋７％）邋［％２１］。因此，研宄該類(lèi)化合物在體對(duì)其藥物開(kāi)發(fā)至關(guān)重要。逡逑

邐Ｍｏｒｕｓｉｉｉ逡逑ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋（ｊｉＭ）逡逑圖３－２桑辛素對(duì)ＨＩＶ－１ＳＦ１６＾Ｈ鏡囊種蘋(píng)钚裕ǎ粒┘岸裕裕冢停

本文編號(hào)：2743426