【摘要】：多酚是一種重要的植物次生代謝物,在水果、蔬菜等植物性食物中大量存在,植物多酚對(duì)糖代謝的積極干預(yù)作用已經(jīng)受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。我國(guó)蠶桑產(chǎn)業(yè)體量居世界首位,豐富的桑葉資源主要用于養(yǎng)蠶農(nóng)業(yè)生產(chǎn),其重要的食用和藥用價(jià)值未得到充分利用與開發(fā)�，F(xiàn)代藥理學(xué)研究已證實(shí)了桑葉多酚輔助降血糖的生物活性,但大部分研究均以桑葉粗提物為原料,且桑葉多酚降血糖的分子機(jī)制研究結(jié)果不盡統(tǒng)一。因此,本研究在分析6個(gè)代表性桑品種桑葉酚類單體組成的基礎(chǔ)上,利用大孔吸附樹脂建立了桑葉多酚富集工藝條件,制備桑葉多酚精制物。以碳水化合物消化吸收的關(guān)鍵酶-二糖酶為研究對(duì)象,探究桑葉多酚對(duì)不同來(lái)源二糖酶的抑制作用,并且通過(guò)建立Caco-2單層細(xì)胞腸道吸收模型來(lái)探究其對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響并初步探討其作用機(jī)制。1、不同桑品種的桑葉總多酚及單體酚類物質(zhì)分析。通過(guò)高效液相色譜外標(biāo)法,系統(tǒng)分析并比較了大10、抗青10號(hào)、阿2、69、農(nóng)桑14、粵桑11號(hào)6個(gè)品種桑葉的多酚單體。結(jié)果發(fā)現(xiàn),6個(gè)品種的桑葉均檢測(cè)到綠原酸、香草酸等12種酚類單體,僅阿2檢測(cè)到?jīng)]食子酸,不同品種桑葉酚類單體組成差異明顯。按各品種單體酚含量總和計(jì),多酚含量由高至低排列順序?yàn)?阿269抗青10號(hào)大10農(nóng)桑14粵桑11,由于阿2和69均不是生產(chǎn)上廣泛栽培的品種,產(chǎn)量有限,因此選擇生產(chǎn)用品種抗青10號(hào)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、桑葉多酚富集工藝優(yōu)化。以桑葉多酚富集效果為考查指標(biāo),篩選出吸附和解吸能力最佳的D101型樹脂,建立了分離純化桑葉多酚的最佳工藝:進(jìn)料液多酚濃度1mg/mL、pH 3.0、上樣流速1 mL/min、上樣量11BV,吸附結(jié)束后,先采用1 BV10%的乙醇進(jìn)行部分去雜,然后分別用3 BV30%乙醇和3 BV50%的乙醇以1 mL/min的流速洗脫收集。純化后,總酚純度由純化前的20.03%提高到75.67%。3、桑葉多酚對(duì)二糖酶的抑制作用。桑葉多酚對(duì)小鼠來(lái)源和Caco-2細(xì)胞來(lái)源的二糖酶均具有強(qiáng)烈的抑制作用,且隨著桑葉多酚濃度的增加,抑制作用逐漸增強(qiáng),其半數(shù)抑制濃度IC50值排序順序?yàn)?鼠源蔗糖酶鼠源麥芽糖酶Caco-2細(xì)胞麥芽糖酶Caco-2細(xì)胞蔗糖酶,桑葉多酚對(duì)Caco-2細(xì)胞上蔗糖酶的抑制作用最強(qiáng)。對(duì)小鼠來(lái)源的酶,桑葉多酚對(duì)麥芽糖酶的抑制作用更強(qiáng),即主要是通過(guò)抑制麥芽糖酶活性而起到改善血糖的作用;對(duì)來(lái)自Caco-2細(xì)胞的酶,桑葉多酚對(duì)蔗糖酶的抑制作用更強(qiáng),即主要是通過(guò)抑制蔗糖酶活性而起到改善血糖的作用。4、桑葉多酚對(duì)Caco-2細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。通過(guò)建立Caco-2單層細(xì)胞模型模擬人體小腸對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),在0.5-2 mg/mL濃度范圍內(nèi),桑葉多酚能夠顯著抑制葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn),并且隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)和多酚濃度的增大,其抑制率也增大。根皮苷(SGLT1抑制劑)對(duì)照組對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響也呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì),這揭示了桑葉多酚可能主要是通過(guò)抑制SGLT1從而發(fā)揮抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。熒光定量PCR結(jié)果顯示:桑葉多酚對(duì)SGLT1、GLUT2、PLC、PKA、PKC的基因表達(dá)均呈現(xiàn)抑制作用。在基因水平上推測(cè)其可能的信號(hào)通路為:桑葉多酚通過(guò)下調(diào)PLC和PKA的表達(dá),PLC進(jìn)而下調(diào)PKC的表達(dá),PKC和PKA共同下調(diào)SGLT1的表達(dá),PKC激活GLUT2轉(zhuǎn)移至頂膜發(fā)揮葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的作用也降低,從而降低機(jī)體對(duì)葡萄糖的吸收。
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S888.2;R285
【圖文】：

1.1 植物多酚的種類和分布多酚是植物中分布廣泛、種類繁多的代謝產(chǎn)物，基本化學(xué)結(jié)構(gòu)特征是苯酚與一個(gè)或多個(gè)羥基基團(tuán)相連形成的共軛結(jié)構(gòu)。已經(jīng)報(bào)道的植物多酚類化合物種類繁多，從簡(jiǎn)單的小分子酚酸到分子量大于30,000Da的高度聚合化合物均可歸于酚類物質(zhì)[1]，按化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異可分為酚酸類、黃酮類、二苯乙烯、香豆素、單寧等5大類�？Х人崾欠铀犷惢衔锏拇硇詥误w，在諸多蔬菜和水果中均有分布。另一種常見(jiàn)的酚酸是阿魏酸，可經(jīng)酯化反應(yīng)結(jié)合在阿拉伯木聚糖和半纖維素的側(cè)鏈殘基上，主要存在于谷物外殼部分。黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)特征是2個(gè)芳香環(huán)和3個(gè)碳原子結(jié)合在一起形成的含氧雜環(huán)，根據(jù)雜環(huán)的類型可分為6類：黃酮、黃烷酮、黃烷醇、黃酮醇、花青素和異黃酮。最常見(jiàn)的黃酮類是槲皮素，是廣泛存在于洋蔥、茶葉、水果的黃酮醇類；兒茶素是常見(jiàn)于于茶和水果中的黃烷醇類；橙色素，廣泛分布于于柑橘類水果中，屬于黃烷酮類；矢車菊素是一種常見(jiàn)的花色素，賦予黑醋栗，覆盆子，草莓等水果鮮艷的顏色，不同水果中含量各不相同。豆類及豆制品中存在大量的異黃酮類，如黃豆苷元、染料木黃酮，因其與雌激素有相似結(jié)構(gòu)，又被稱為植物雌激素[2]。

可為高效開發(fā)降血糖產(chǎn)品提供理論依據(jù)，有助于桑葉資源的精深利用。1.5 主要研究?jī)?nèi)容研究?jī)?nèi)容主要分四個(gè)部分，研究技術(shù)路線見(jiàn)圖1-2。（1）不同桑品種的桑葉總多酚及單體酚類物質(zhì)分析。通過(guò)高效液相色譜法外標(biāo)法，系統(tǒng)分析測(cè)定大 10、抗青 10 號(hào)、阿 2、69、農(nóng)桑 14、粵桑 11 號(hào) 6 個(gè)代表性品種桑葉的多酚單體組成和含量差異，并且篩選出合適的品種進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（2）桑葉多酚富集工藝優(yōu)化。篩選適合桑葉多酚分離的大孔樹脂類型，優(yōu)化大孔樹脂吸附和解吸最佳工藝參數(shù)，分析純化前后桑葉多酚單體組成變化。（3）桑葉多酚對(duì)二糖酶的抑制作用研究。分別探討桑葉多酚提取物對(duì)小鼠腸道來(lái)源的蔗糖酶和麥芽糖酶、Caco-2 細(xì)胞上的蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制作用。（4）桑葉多酚對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。通過(guò) Caco-2 單層細(xì)胞腸道吸收模型研究桑葉多酚提取物對(duì) Caco-2 細(xì)胞上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，推測(cè)其主要影響的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。明確了桑葉多酚通過(guò)影響 SGLT1、GLUT2、PKA、PKC、PLC 等關(guān)鍵細(xì)胞因子抑制葡萄糖吸收的調(diào)控通路，初步探明桑葉多酚在二糖消化過(guò)程中的分子機(jī)制。圖 1-2 主要研究路線Fig 1-2 Main research route

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