發(fā)布時(shí)間：2020-06-25 04:48

【摘要】：目的:觀察外源性線粒體損傷相關(guān)分子模式(MTDs)對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞(AM)的致炎作用,以及自噬對(duì)MTDs誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響,初步探討自噬調(diào)控MTDs致炎作用的分子機(jī)制。方法:提取SD大鼠肝臟組織MTDs,采用Janus Green B進(jìn)行線粒體染色;體外培養(yǎng)NR8383細(xì)胞,分別予non-MTDs、MTDs、LPS+Nigericin、RAPA+MTDs、3-MA+MTDs、MCCC950、MCCC950+MTDs處理,采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-18含量,采用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中NLRP3、ASC、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β的表達(dá)和上清液中成熟caspase-1、IL-1β含量,采用免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞中LC3標(biāo)記自噬小體和ASC聚合體形成,采用透射電子顯微鏡檢測(cè)自噬小體形成,采用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中NLRP3、ASC和caspase-1mRNA的表達(dá)。結(jié)果:1、Janus Green B染色顯示成功富集線粒體;MTDs刺激AM后,上清液中TNF-α、IL-1β和IL-18含量較control組或non-MTDs處理組顯著升高,細(xì)胞中NLRP3、ASC和Pro-caspase-1蛋白表達(dá)增多。2、RAPA預(yù)處理AM后予以MTDs刺激,自噬小體較control組或單純MTDs組增多,3-MA預(yù)處理AM后未見自噬小體;與MTDs組相比,RAPA+MTDs組上清液中IL-1β和IL-18含量減少,TNF-α含量無(wú)明顯變化,3-MA+MTDs組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-18含量變化無(wú)顯著差異。3、RAPA或3-MA預(yù)處理的AM予以MTDs刺激,與MTDs組相比,RAPA+MTDs組上清液中成熟caspase-1和IL-1β含量,以及細(xì)胞中ASC聚合體、NLRP3、ASC和Pro-caspase-1蛋白表達(dá)均顯著減少,相反,3-MA+MTDs組均無(wú)顯著差異;但是RAPA和3-MA預(yù)處理對(duì)MTDs誘導(dǎo)AM細(xì)胞中Pro-IL-1β蛋白和NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA表達(dá)均無(wú)顯著影響。4、MCC950預(yù)處理AM后予以MTDs刺激,與MTDs組相比,MCC950組細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18含量明顯降低,成熟caspase-1和IL-1β含量顯著減少,細(xì)胞中ASC聚合體形成減少,但是上清液中TNF-α含量以及細(xì)胞中Pro-caspase-1和Pro-IL-1β蛋白表達(dá)無(wú)顯著改變。結(jié)論:外源性MTDs可以誘導(dǎo)大鼠AM炎癥因子分泌和NLRP3炎性體相關(guān)蛋白表達(dá),誘導(dǎo)自噬可以減輕MTDs誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),初步分析其機(jī)制主要是自噬降低MTDs活化的NLRP3炎性體的穩(wěn)定性,促進(jìn)其降解,減少caspase-1活化,抑制炎性體特異性炎癥因子IL-1β和IL-18成熟和分泌。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

第 1 章 引言器給溶酶體，進(jìn)行降解，以利于細(xì)胞重新利用的過(guò)程，因此自噬被認(rèn)為是一種胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)再利用的機(jī)制[33]。Saitoh 等[34]敲除 ATG16L1，抑制自噬小體形成，降低自噬相關(guān)的降解，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞 caspase-1 活化，促進(jìn)炎癥因子 IL-1β 和 IL-18成熟和分泌，增強(qiáng)內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠的炎癥反應(yīng)。而敲除自噬相關(guān)基因或 3-MA 處理抑制自噬可增強(qiáng) NLRP3 炎性體活化，促進(jìn)炎癥因子分泌，促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，增加膿毒癥死亡率[35,36]。相反，自噬誘導(dǎo)劑可以抑制 NLRP3 炎性體活化，減輕 DAMP 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[37,38]。這些研究表明，自噬可抑制 NLRP3 炎性體活化，減少炎性體特異性炎癥因子的分泌，改善炎性體相關(guān)疾病，但自噬對(duì) MTDs誘導(dǎo)的 NLRP3 炎性體活化的調(diào)控作用仍未見報(bào)道，基于以上研究推測(cè)，自噬可能通過(guò)減少 MTDs 誘導(dǎo)的 NLRP3 炎性體活化，減輕 AM 炎癥反應(yīng)，從而改善創(chuàng)傷后 ARDS（圖 1-1）。

第 3 章 結(jié)果第 3 章 結(jié)果3.1 MTDs 誘導(dǎo) AM 炎癥反應(yīng)3.1.1 線粒體 Janus Green B 染色提取線粒體后，采用 Janus Green B 對(duì)線粒體進(jìn)行染色觀察。線粒體經(jīng) JanusGreen B 染色后，內(nèi)膜呈藍(lán)綠色，線粒體懸液光鏡下可見大量藍(lán)綠色線粒體，而去線粒體上清中，只看到極少量藍(lán)綠色的線粒體（圖 3-1），提示成功獲得高濃度線粒體。

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本文編號(hào)：2728880