【摘要】：研究背景及目的非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)被認為是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn),其發(fā)病率不斷上升,目前已超越慢性乙型肝炎成為國內(nèi)外第一大慢性肝病。近年來,隨著腸肝軸理論的提出,以腸道菌群為靶點研究NAFLD的發(fā)病機制越來越受到大家的重視。護肝清脂片(Hugan Qingzhi Tablet,HQT)在臨床上主要用于防治NAFLD,體內(nèi)體外試驗均證實1.08g/kg的HQT可有效改善NAFLD大鼠胰島素抵抗、脂質(zhì)蓄積、慢性炎癥,但具體藥效機制仍有待闡明。本團隊前期蛋白質(zhì)組學實驗中發(fā)現(xiàn)與高脂飼料(high fat diet,HFD)組對比,HQT可上調(diào)NAFLD大鼠肝臟微生物代謝通路的表達,初步提示護肝清脂片防治NAFLD的機制有可能與腸道菌群有關(guān)。HQT主要成分包括澤瀉、山楂、蒲黃、荷葉及三七,本團隊前期采用UHPLC-QqQ-MS檢測發(fā)現(xiàn)HQT中含有大量黃酮類成分如異鼠李素、槲皮素、蘆丁及香蒲新苷等成分,文獻報道腸道菌群可廣泛代謝黃酮類成分,影響其生物活性,反過來,黃酮類成分如蘆丁、槲皮素等也可調(diào)節(jié)代謝綜合征導致的機體腸道菌群紊亂,考慮到HQT為口服給藥,不可避免的會與機體胃腸道發(fā)生接觸,我們推測,護肝清脂片很可能是通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、保護腸黏膜屏障等機制起到防治NAFLD的作用。研究方法1、采用高脂飼料建立NAFLD大鼠模型,將大鼠隨機分為3組:普通飼料(Normal fat diet,NFD)組、高脂飼料(High fat diet,HFD)組、1.08g/kg HQT+高脂飼料組,12周結(jié)束后,測定各組大鼠的肝脂質(zhì)含量、炎癥指標水平,油紅O染色及蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)切片觀察各組大鼠肝組織病變程度。2、運用16SrRNA測序技術(shù)來研究HQT對NAFLD大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及功能的調(diào)節(jié)作用。3、運用GC-MS方法對實驗結(jié)束后各組大鼠糞便短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)的含量進行測定。4、采用ELSA試劑盒測定各組大鼠血清LPS含量,運用HE染色法觀察各組大鼠回腸粘膜組織病理變化,并運用免疫組化法觀察各組大鼠回腸粘膜緊密連接蛋白claudin-1和ZO-1的表達和分布,同時采用qRT-PCR及Western blotting試驗觀察各組大鼠肝臟Toll樣受體4(TLR4)信號通路的表達。研究結(jié)果1、動物實驗表明HQT可降低NAFLD模型大鼠肝組織勻漿甘油三脂(triglyceride,TG),膽固醇(cholesterol,CHOL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein-cholesterol,LDLC)等指標水平,同時顯著升高高密度脂蛋白(high-density lipoprotein-cholesterol,HDLC)水平;此外,還可顯著抑制腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)及白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)炎癥因子水平;肝組織油紅O及HE切片染色結(jié)果顯示,HQT可顯著改善NAFLD大鼠肝細胞脂質(zhì)沉積。2、16SrRNA測序結(jié)果顯示:①HQT的干預提高了NAFLD大鼠與NFD組大鼠腸道菌群OTU組成的相似性;②降低了NAFLD大鼠腸道菌群中的厚壁菌門/擬桿菌門(Firmicutes to Bacteroidetes,F/B)的比值;③促進了norank f Bacteroidales S24 7 group 和 Ruminococcaceae,Bifidobacterium、Alistipe和Anaeroplasma等有益菌的生長,同時抑制了有害菌Cronobacter,Streptococcus,Holdemanella及Blautia的滋生;④環(huán)境因子相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Blautia和Holdenmanella與NAFLD相關(guān)疾病指 TG,CHOL,LDL-C,IL-6,IL-1β,TNF-α及大鼠體重呈顯著性正相關(guān),與HDL-C呈顯著性負相關(guān)(p0.001);而norank_f__Bacteroidales_S24-7_gropup Alistipes 2個菌屬則呈現(xiàn)相反趨勢(p0.001);⑤16S功能預測分析提示,相較于HFD組,HQT組大鼠腸道菌群類黃酮生物合成代謝途徑表達顯著性增強(p0.05)。3、與HFD組對比,HQT組大鼠腸道內(nèi)除乙酸鹽之外,丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、異戊酸及己酸,總SCFAs含量水平均顯著性升高(p0.01)。4、HQT的干預可顯著降低NAFLD大鼠體內(nèi)血清內(nèi)毒素的含量(p0.05),回腸組織HE切片染色結(jié)果顯示,HQT可抑制腸上皮細胞壞死脫落,減輕NAFLD大鼠腸黏膜固有層的水腫以及有效降低腸黏膜中的炎性細胞含量,HQT可顯著上調(diào)NAFLD大鼠回腸組織粘膜claudin-1和ZO-1的表達(p0.01),護肝清脂片可顯著抑制NAFLD大鼠肝臟TLR4信號通路蛋白TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)、核因子κB(NF-κB)的表達(p0.05)。結(jié)論HQT可通過調(diào)節(jié)NAFLD大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu),抑制有害菌,促進有益菌的生長,促進丙酸、丁酸等SCFAs的含量生產(chǎn),減少LPS的產(chǎn)生,促進腸緊密連接蛋白claudin-1和ZO-1的表達,降低腸黏膜機械屏障的通透性,并下調(diào)肝臟TLR4信號通路,從而減少有害菌及其代謝產(chǎn)物經(jīng)腸道血流經(jīng)門靜脈進入肝臟,起到改善肝臟脂質(zhì)沉積及炎癥的效果。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

油紅０染色定量提示經(jīng)過１２周高脂飲食的喂養(yǎng)，ＨＦＤ組大鼠肝臟油紅０逡逑染色切片提示脂質(zhì)沉積將近４１．８７％，而護肝清脂片可以顯著降低ＮＡＦＬＤ大鼠逡逑肝臟脂質(zhì)沉積（

｜邋０－＊邐■邐．邐逡逑＾邋＾邋＊逡逑圖１－６各組大鼠肝臟ＨＥ染色ＮＡＳ評分結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．邋１－６．邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＮＡＳ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｒａｔｓ邋ｇｒｏｕｐ５邋ｌｉｖｅｒ邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ逡逑注：以上數(shù)據(jù)以ｍｅａｎ士ＳＤ的形式表示，其中＞＜０．０５，邋＞＜０．０１，表示和ＨＦＤ組比較逡逑有統(tǒng)計學意義；＃ｐ＜0．0５，邋＃＃ｐ＜０．０１，表示和ＮＦＤ組比較有統(tǒng)計學意義。（每組８只大鼠）逡逑３．５．２．４油紅Ｏ染色評分結(jié)果逡逑油紅０染色定量提示經(jīng)過１２周高脂飲食的喂養(yǎng)，ＨＦＤ組大鼠肝臟油紅０逡逑染色切片提示脂質(zhì)沉積將近４１．８７％，而護肝清脂片可以顯著降低ＮＡＦＬＤ大鼠逡逑肝臟脂質(zhì)沉積（圖１－７）。逡逑１６逡逑

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