【摘要】：目的研究淡豆豉(Sojae Semen Praeparatum)的抗抑郁作用與γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid,GABA)含量的關(guān)系,分析淡豆豉炮制過程中高富集GABA的影響因素,為科學闡釋淡豆豉的“除煩”功效和揭示淡豆豉炮制中GABA形成機理奠定基礎(chǔ)。方法1、本實驗室前期參照2015版《中國藥典》已建立規(guī)范的淡豆豉炮制工藝,本研究按此炮制工藝制備淡豆豉,獲取各炮制不同時間點樣本。2、應(yīng)用慢性溫和不可預知性應(yīng)激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁模型,研究淡豆豉的抗抑郁作用與GABA含量的關(guān)系。(1)GABA含量測定:應(yīng)用本課題組前期建立的柱前在線衍生高效液相色譜技術(shù)(HPLC-OPA)測定淡豆豉炮制過程中不同時間點樣本的GABA含量。(2)CUMS抑郁模型制備:100只昆明小鼠(Kunming mice,KM)按體重隨機分為空白組、模型組、鹽酸氟西汀組、GABA組、黑大豆組、發(fā)酵6 d組、再悶6 d、組、再悶15 d高、中、低劑量組。每組10只,雌雄各半。每只單籠飼養(yǎng)。連續(xù)28天,按每天1種或2種刺激隨機交替建立CUMS抑郁小鼠模型。除空白對照組外,其余各組均采取單籠飼養(yǎng)及以下慢性應(yīng)激刺激:禁食24 h,禁水24 h,潮濕墊料24 h,夾尾1 min(以小鼠發(fā)出哀鳴聲為宜),45℃熱水游泳3 min,斜籠24 h,4℃冷水刺激3 min,震蕩2 min,通宵照明24 h,共9種刺激每天隨機選取一種應(yīng)激,持續(xù)應(yīng)激28 d,使小鼠無法預知將要給予的應(yīng)激。具體安排如下:第1、11、20 d為禁水;第2、10、21、28 d夾尾;第3、12、19 d為潮濕墊料;第4、13、24 d為熱刺激;第5、15、22 d為禁食;第6、16、23 d為斜籠;第7、14、26 d為冷刺激;第8、18、27 d為通宵照明;第9、17、25 d為震蕩。造模同時連續(xù)灌胃給藥28 d,觀察體重、懸尾、強迫游泳、敞箱、糖水偏好等行為學指標的變化。3、淡豆豉炮制過程中影響GABA富集的主次因素初步分析應(yīng)用相關(guān)性分析、多元回歸分析等統(tǒng)計學分析方法,分析淡豆豉炮制中pH、溫度、水分、蛋白酶(酸、中、堿性)和谷氨酸脫羧酶(Glutamic acid decarboxylase,GAD)各指標在GABA形成中的主次地位。(1)淡豆豉炮制過程中相關(guān)指標的檢測:利用pH計、溫度計、干燥失重法、福林酚法及Berthelot顯色法分別測定淡豆豉炮制過程中pH、溫度、水分、蛋白酶和GAD等指標的動態(tài)變化,應(yīng)用柱前在線衍生HPLC-OPA方法測定淡豆豉炮制過程中GABA的動態(tài)變化。(2)統(tǒng)計學方法分析:以淡豆豉炮制過程中各個指標含量為橫坐標,以相應(yīng)時間點樣本的GABA含量為縱坐標作散點圖,并進行相關(guān)性分析和線性回歸分析。用Pearson相關(guān)系數(shù)分別對各指標與GABA含量的相關(guān)性進行評價,用雙尾檢驗法評價顯著水平。用R~2對線性回歸模型進行評價,F檢驗法評價其回歸方程的顯著性。在此基礎(chǔ)上建立多元回歸方程,通過比較各因素系數(shù)絕對值的大小,明確各指標在GABA形成中的主次地位。4、淡豆豉炮制中產(chǎn)GABA微生物的產(chǎn)GAD能力分析根據(jù)淡豆豉炮制過程中影響GABA形成的主要因素,研究各優(yōu)勢微生物在不同pH和溫度下產(chǎn)GAD的能力。結(jié)果1、按本實驗室前期建立的淡豆豉炮制工藝制備淡豆豉,獲得以下不同時間點樣本:黑大豆(H)、“黃衣上遍”階段為發(fā)酵0、3、6 d(分別記為F0、F3、F6)“再悶”階段為再悶3、6、9、12、15 d(分別記為Z3、Z6、Z9、Z12、Z15),成品性狀:表面黑色,皺縮不平,質(zhì)柔軟,斷面棕黑色,氣濃郁,味微甘。樣品性狀和各項理化指標均符合2015版《中國藥典》要求。2、淡豆豉的抗抑郁作用及其與GABA含量的關(guān)系(1)各藥物組中GABA含量:按前期建立的發(fā)酵炮制工藝獲取淡豆豉炮制不同時間點樣品,并測定樣品煎煮液中GABA含量,此次運用柱前在線衍生色譜技術(shù)在黑大豆和發(fā)酵6 d中未檢測出GABA,再悶6 d和再悶15 d的GABA含量分別為5.559 mg/g、8.421 mg/g。(2)淡豆豉抗抑郁作用與GABA的關(guān)系:采用單籠飼養(yǎng)加慢性溫和不可預知性應(yīng)激復制抑郁模型,連續(xù)給藥28 d后,各行為學指標變化如下:與空白組比較,模型組的體重、糖水偏好、跨格數(shù)和直立數(shù)均減少(p0.01);懸尾及游泳不動時間增加(p0.05);表明CUMS抑郁模型建造成功。與模型組比較,體重:造模前各組均無差異(p0.05),造模后鹽酸氟西汀組、GABA組、再悶6 d組、再悶15 d高、中劑量均增加(p0.05),黑大豆組、發(fā)酵6 d組及再悶15 d低劑量組無差異(p0.05);糖水偏好:造模前各組間無差異(p0.05),造模后陽性藥組、GABA組、再悶6 d組(p0.01)及再悶15 d高、中劑量(p0.05)均增加,黑大豆組、發(fā)酵6 d組及再悶15 d低劑量組均無差異(p0.05);敞箱實驗:造模前各組的跨格數(shù)、直立數(shù)均無差異(p0.05),造模后陽性藥組、GABA組、再悶6 d組、再悶15 d高、中劑量跨格數(shù)增多(p0.01),黑大豆組、發(fā)酵6 d組及再悶15 d低劑量組均無差異(p0.05);陽性藥組、GABA組(p0.01)、再悶15 d高劑量組(p0.05)的直立數(shù)增加,黑大豆組、發(fā)酵6 d組、再悶6 d組及再悶15 d中、低劑量組均無差異(p0.05)。懸尾實驗:陽性藥組、GABA組、再悶6 d組及再悶15 d高、中劑量組不動時間均減少(p0.01),黑大豆組、發(fā)酵6 d組及再悶15 d低劑量組均無差異(p0.05)。強迫游泳實驗:各組游泳不動時間均縮短(p0.01)。3、淡豆豉炮制過程中影響GABA富集的主次因素(1)淡豆豉炮制過程中各指標的動態(tài)變化:(1)GABA含量:在炮制前原料黑大豆中含有微量GABA,進入“黃衣上遍”階段未檢測出GABA,洗去黃衣進入“再悶”階段后,GABA含量逐漸增加,至再悶15 d后含量穩(wěn)定。(2)pH值:淡豆豉炮制過程中pH值總體處于偏弱酸性呈現(xiàn)先增后減的趨勢。(3)溫度:炮制體系的溫度呈逐漸下降的趨勢,在“黃衣上遍”初始階段溫度最高。(4)水分:水分在“黃衣上遍”階段逐漸降低,進入再悶階段后逐漸增加后趨于穩(wěn)定。(5)蛋白酶:淡豆豉炮制過程中酸、中、堿性蛋白酶均呈現(xiàn)先減后增再減的趨勢,酸性、中性蛋白酶及堿性蛋白酶最高分別達11.88 U/g、116.56 U/g和69.20 U/g。(6)GAD:GAD活性總體呈現(xiàn)先減后增,于再悶15 d時活性高達17.64 U/g。(2)淡豆豉炮制中GABA富集的主次因素:淡豆豉炮制過程中水分和酸性蛋白酶與GABA相關(guān)性系數(shù)分別為0.211和-0.340,p值分別為0.324和0.228,相關(guān)性較小且無統(tǒng)計學差異;比較回歸系數(shù)絕對值的大小可知,其它各指標在GABA形成中的主次地位為pH(-0.375)溫度(-0.284)GAD(0.140)堿性蛋白酶(0.047)中性蛋白酶(-0.030),其中pH、溫度和中性蛋白酶與GABA具有負相關(guān)性,GAD活力和堿性蛋白酶與GABA存在正相關(guān)性。4、淡豆豉炮制中產(chǎn)GABA微生物的產(chǎn)GAD能力:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Xd_3和鳥腸球菌(Enterococcus avium)15R_3在pH=6.0、溫度為34℃時產(chǎn)GAD活力最高,此時GAD酶活分別達19.43 U/h和11.18 U/h;屎腸球菌(Enterococcus faecium)15r_1在pH為5、溫度為31℃時產(chǎn)GAD能力最高,酶活達3.41 U/h;極細支孢霉(Cladosporium cladosporioides)ME_4在pH為4、溫度為28℃時產(chǎn)GAD較強,酶活為11.50 U/h;黃曲霉(Aspergillus flavus)MB_2和桔青霉(Penicillium citrinum)ME_3均是在pH為7、溫度為28℃時產(chǎn)GAD能力最高,酶活分別為41.97、3.44 U/h;黑曲霉(Aspergillus niger)JD_2在pH為7、溫度為31℃時最適產(chǎn)GAD,酶活為25.78 U/h;溜曲霉(Aspergillus tamarii)MA_3在pH為8、溫度為28℃時最適產(chǎn)GAD,酶活為12.49 U/h;白腐菌(Phanerochaete sordida)MG_1在pH為6、溫度為25℃時最適產(chǎn)GAD,酶活達15.74 U/h。結(jié)論1.本實驗按前期建立的淡豆豉炮制工藝制備淡豆豉其成品性狀和各項理化指標均符合2015版《中國藥典》要求。2.本研究首次運用經(jīng)典的CUMS抑郁模型來評價淡豆豉的除煩作用,結(jié)果表明淡豆豉對模型小鼠的抑郁行為有較好改善作用,抗抑郁作用與樣本的GABA含量有關(guān),為后期進一步明確淡豆豉除煩功效的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。3.淡豆豉炮制過程中pH、溫度、GAD、中性及堿性蛋白酶等指標對GABA的形成有重要的影響,其主次順序為pH溫度GAD堿性蛋白酶中性蛋白酶。4.淡豆豉炮制過程中各優(yōu)勢菌種最適產(chǎn)GAD的條件也不盡相同,各菌株最適產(chǎn)GAD的條件與淡豆豉自然炮制條件范圍相吻合,為進一步闡明淡豆豉炮制過程中GABA動態(tài)變化的機制奠定基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：江西中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：
3. 結(jié)果與分析3.0 淡豆豉炮制不同時間點樣品性狀本實驗室結(jié)合相關(guān)文獻和歷版《中國藥典》建立了規(guī)范的淡豆豉炮制工藝，按此工藝制備淡豆豉。淡豆豉炮制不同時間點樣品見圖 1-1，淡豆豉炮制 0-6 d為“黃衣上遍”階段， 此過程豆粒逐漸長滿黃衣，待發(fā)酵至第 6 d 時“黃衣上遍”；洗去黃衣進入“再悶”階段，“再悶”階段豆粒逐漸皺縮不平，體積縮小且質(zhì)軟，伴有一定的酒香氣味。
分組 第 0 d 第 7 d 第 14 d 第 21 d 第 28 d模型組 23.88±1.72 26.33±2.83△△28.51±3.59△△30.75±3.46△△29.62±2.28△△空白組 23.82±1.93 30.10±3.56**34.06±4.87**35.91±5.18**37.37±5.16**陽性藥物組 23.83±2.22 29.48±2.19*32.95±3.30**34.87±3.98*33.49±3.59*GABA 組 23.92±1.46 29.26±1.73*32.44±2.25*35.08±3.14*33.50±2.13*H 組 23.58±1.93 28.38±2.42 31.20±3.12 32.77±2.50 31.87±2.91F6 組 23.83±1.85 27.87±2.66 30.51±3.29 32.74±3.69 31.73±3.43Z6 組 23.96±1.92 29.10±3.14*32.25±3.47*34.68±3.72*32.93±2.91*高劑量 24.00±1.80 28.07±3.64 31.63±4.11 34.49±4.43*32.93±5.18*Z15 中劑量 23.64±1.70 28.68±3.65 31.97±3.95* 34.88±4.34*33.26±3.69*低劑量 24.08±1.77 29.06±3.67 31.58±4.17 34.36±4.61 32.85±3.99注：與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01；與空白組比較，△p<0.05，△△p<0.01
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