【摘要】：第一部分目的:研究棕櫚酸(PA)在HK-2細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用以及黃芪甲苷(Astragaloside IV,ASIV)在PA誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用,為ASIV在糖尿病腎病的防治中提供相關(guān)理論依據(jù)。方法:體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞,對(duì)其分組如下:牛血清白蛋白(BSA)對(duì)照組、PA組與ASⅣ不同劑量(10,20,40μmol/L)給藥組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性;油紅染色法觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況;BODIPY?FL C16熒光染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)運(yùn)輸情況;Hoechst-33258、Annexin-V/FITC/PI雙標(biāo)記熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況;ROS活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)情況;Western blot測(cè)定HK-2細(xì)胞內(nèi)ATF4、CHOP、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase 3、p-Nrf2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:ASⅣ濃度在0-100μmol/L時(shí)對(duì)HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響;結(jié)果顯示200μmol/L的棕櫚酸能夠誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的凋亡,增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。ASIV(10,20,40μmol/L)可以明顯減少棕櫚酸誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的凋亡數(shù)目,降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,減少細(xì)胞內(nèi)活性氧含量。棕櫚酸誘導(dǎo)后HK-2細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白ATF4、CHOP表達(dá)升高,氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白p-Nrf2含量降低,凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase 3表達(dá)增加。而給予ASIV后,可以明顯降低ATF4、CHOP、Bax、Cleaved-caspase 3含量,并升高p-Nrf2的含量。結(jié)論:ASⅣ能夠抑制棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的凋亡,其作用機(jī)制可能與ASⅣ能夠降低凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase3的含量,可以減少細(xì)胞內(nèi)ROS的含量,升高HK-2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和p-Nrf2的表達(dá)水平有關(guān)。第二部分目的:研究ASIV在保護(hù)HK-2細(xì)胞防止其凋亡的過(guò)程中,其發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制。進(jìn)一步探討氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在HK-2細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用。方法:體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞,對(duì)其分組如下:牛血清白蛋白(BSA)對(duì)照組、PA組、ASⅣ40μmol/L給藥組、Tempol給藥組以及4苯基丁酸(4-phenybutyric acid,4-PBA)給藥組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性;Hoechst-33258、Annexin-Ⅴ/FITC/PI雙標(biāo)記熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況;ROS活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS沉積情況;Western blot測(cè)定HK-2細(xì)胞內(nèi)ATF4、CHOP、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase 3、P-nrf2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:細(xì)胞給予Tempol或者4-PBA后均可改善細(xì)胞凋亡情況,減少細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。氧化應(yīng)激抑制劑Tempol,不僅能夠降低細(xì)胞內(nèi)ROS的含量,升高p-Nrf2蛋白含量,而且也能改變細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的含量,減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡蛋白ATF4、CHOP的表達(dá);同樣我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA,不僅能夠降低相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白含量,也能夠改善細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)情況,降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量,并增加p-Nrf2蛋白的表達(dá)。結(jié)論:棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與PA刺激后細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的氧化應(yīng)激以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。ASIV對(duì)PA誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用,ASIV的保護(hù)機(jī)制可能是由于ASIV能夠降低氧化應(yīng)激以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)反應(yīng),從而起到細(xì)胞的保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
【圖文】：

圖 1 光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞不同形態(tài)(200×)Fig.1 Cell morphology and viability test. (A): Normal cells. (B): BSA control cells. (C): PA 24 hours afterstimulation cells. (200×)

圖 2. PA 和 ASIV 對(duì) HK-2 細(xì)胞活力的影響(MTT 法)ffect of PA and ASIV on HK-2 cell viability (MTT). (A): The cytotoxicity of ASIV with difftrations, (B): The cytotoxicity of PA with different concentrations, (C): The protective effect of ASIell damage induced by PA. Data were expressed as mean ± SD, n=3,**p < 0.01,***p< 0.001 ve

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