【摘要】：研究背景及目的胃癌(Gastric cancer,GC)作為世界第四大最常見(jiàn)的癌癥,是目前全球范圍內(nèi)亟待解決的重大公共健康問(wèn)題,據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,全球平均每年約有99萬(wàn)人被診斷為胃癌,73.8萬(wàn)人死于胃癌,因此它也是癌癥性死亡的第二大兇手。胃癌的發(fā)病率會(huì)根據(jù)年齡,性別和地域等不同而有所差異,好發(fā)年齡在50歲以上,男性胃癌的發(fā)病率是女性的2至3倍,全球范圍來(lái)看,包括中國(guó)在內(nèi)的亞洲東部、歐洲東部以及南美等地區(qū)發(fā)病率最高,而北美以及非洲大部分地區(qū)發(fā)病率最低。而隨著現(xiàn)代人生活節(jié)奏的加快,飲食結(jié)構(gòu)的改變,學(xué)習(xí)及工作壓力的增加,胃癌發(fā)病人群呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。具體到我國(guó),流行病學(xué)調(diào)查分析顯示,我國(guó)胃癌發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的42.6%和45.0%,在全球183個(gè)國(guó)家中位于發(fā)病率第5位、死亡率第6位。2012年中國(guó)胃癌新發(fā)病例約為42.4萬(wàn)例,其中男性新發(fā)病例約為29.8萬(wàn)例,女性為12.6萬(wàn)例。全國(guó)總?cè)丝诩澳行晕赴┌l(fā)病率均僅次于肺癌,位居同期惡性腫瘤發(fā)病率的第2位,女性胃癌發(fā)病率低于乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌,位居第4位。2012年中國(guó)胃癌死亡病例約為29.8萬(wàn)例,其中男性死亡病例約為20.6萬(wàn)例,女性約為9.2萬(wàn)例。全國(guó)胃癌死亡率為22.04/10萬(wàn)。全國(guó)總?cè)丝诩澳行晕赴┧劳雎蕛H低于肺癌和肝癌,位居同期惡性腫瘤死亡率第3位,女性胃癌死亡率僅低于肺癌,位居第2位。我國(guó)是胃癌高發(fā)國(guó)家,胃癌仍是嚴(yán)重危害中國(guó)居民健康的主要疾病之一,降低我國(guó)胃癌的發(fā)病率和死亡率越來(lái)越成為我們必須直面的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前,大多數(shù)胃癌患者被診斷為晚期胃癌,65%~75%有根治愿望的患者在接受治療后面臨的是復(fù)發(fā)及系統(tǒng)性疾病的結(jié)局。近年來(lái),隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,胃癌診療技術(shù)不斷提高,尤其是手術(shù)、內(nèi)鏡技術(shù)、放化療、靶向治療等綜合治療方式的進(jìn)步,胃癌的治療效果有所提升,但對(duì)于晚期及伴轉(zhuǎn)移病灶的胃癌患者,綜合治療的預(yù)后仍不理想。對(duì)于被診斷為不適宜手術(shù)的原位癌或轉(zhuǎn)移癌的患者,化療是重要的臨床治療手段,常用藥物有奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶(5-FU)、多西他賽、伊立替康等,但由于上述藥物在長(zhǎng)期應(yīng)用的情況下耐藥率較高且藥物細(xì)胞毒性作用很大,化療也只能為患者帶去12個(gè)月的中位生存率。因此,尋找低毒、高效的新型化學(xué)藥物用于治療胃癌具有重要意義。葫蘆素(Cucurbitacin)是一組從葫蘆科和十字花科植物中提取的天然三萜系化合物�，F(xiàn)代研究報(bào)道葫蘆素在多種腫瘤疾病中均發(fā)揮抗炎、抗腫瘤的作用,可抑制多種腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡。其中葫蘆素B、D、E、I、F、O、P和Q均可通過(guò)抑制STAT3磷酸化而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與分化。據(jù)報(bào)道,從瓜蔞中提取的葫蘆素D可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡,可以影響Stat3及NF-κB等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。化療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是臨床上腫瘤疾病治療的重要手段,葫蘆素D作為潛在的抗腫瘤藥物具有一定的研究?jī)r(jià)值。但目前關(guān)于葫蘆素D在胃癌細(xì)胞中的作用及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制尚不明確,有待進(jìn)一步研究。在細(xì)胞水平,本課題研究了多濃度梯度、時(shí)間梯度下,葫蘆素D對(duì)胃癌AGS、SNU1、HS76T細(xì)胞增殖和凋亡的影響;應(yīng)用SC79激活A(yù)kt的表達(dá),左旋刀豆氨酸(L-canavanine)抑制iNOS的表達(dá),并探討葫蘆素D發(fā)揮抗胃癌作用的潛在機(jī)制;在組織水平,本課題構(gòu)建了裸鼠移植瘤模型,在體研究葫蘆素D對(duì)胃癌增殖和凋亡的影響,旨在探討葫蘆素D對(duì)胃癌的在體作用及其分子機(jī)制。方法1.應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)不同濃度梯度及時(shí)間梯度下,Cucurbitacin D對(duì)胃癌AGS、SUN1、Hs746T細(xì)胞體外增殖的影響;選用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)不同濃度Cucurbitacin D對(duì)胃癌AGS、SUN1、Hs746T細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響;應(yīng)用TUNEL染色法探討Cucurbitacin D對(duì)胃癌AGS、SUN1、Hs746T細(xì)胞凋亡的影響;還檢測(cè)了不同濃度梯度及時(shí)間梯度下,Cucurbitacin D對(duì)胃癌AGS、SUN1、Hs746T細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)及NO含量的影響。2.通過(guò)Western blot法檢測(cè)了Cucurbitacin D對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的iNOS、Bax等凋亡信號(hào)通路和Akt信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子的蛋白表達(dá)的影響;分別選用iNOS抑制劑L-canavanine干擾胃癌AGS細(xì)胞內(nèi)iNOS的表達(dá),選用Akt激動(dòng)劑SC79干擾胃癌AGS細(xì)胞內(nèi)Akt的活化,應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)L-canavanine及SC79對(duì)Cucurbitacin D介導(dǎo)的抑制胃癌AGS細(xì)胞體外增殖作用的影響;應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)L-canavanine及SC79對(duì)Cucurbitacin D誘導(dǎo)胃癌AGS細(xì)胞體外凋亡作用的影響;給小鼠按1×10~6個(gè)細(xì)胞/只的量注射胃癌AGS細(xì)胞以構(gòu)建胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,給藥途徑選用腹腔注射,觀察并記錄裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)情況,記錄瘤體長(zhǎng)徑和短徑以計(jì)算體積,當(dāng)瘤體體積達(dá)到200mm~3后,給予Cucurbitacin D及SC79腹腔注射;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取材,繪制裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)曲線,檢測(cè)Cucurbitacin D及SC79對(duì)皮下移植瘤瘤體生長(zhǎng)的影響;選用TUNEL法檢測(cè)Cucurbitacin D及SC79對(duì)皮下移植瘤瘤體組織細(xì)胞凋亡情況的影響,以分析探討Cucurbitacin D抗胃癌作用的體內(nèi)外潛在分子機(jī)制。結(jié)果1.CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,Cucurbitacin D對(duì)胃癌AGS、SUN1、Hs746T細(xì)胞體外增殖均有抑制作用,與對(duì)照組相比,Cucurbitacin D處理組的細(xì)胞數(shù)量明顯減少,且該作用呈明顯的濃度及時(shí)間依賴性,即隨著藥物濃度的增加及藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng),其抑制作用逐漸增強(qiáng)(P0.05);ROS檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,胃癌AGS、SUN1、Hs746T細(xì)胞在經(jīng)Cucurbitacin D藥物處理后,其細(xì)胞內(nèi)ROS含量均明顯增加(P0.05),且該作用呈現(xiàn)濃度依賴性,即隨著藥物濃度的增加ROS含量逐漸增多;TUNEL染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,隨Cucurbitacin D濃度增加,胃癌AGS、SUN1、Hs746T細(xì)胞凋亡率均逐漸升高(P0.05);而與對(duì)照組相比,隨Cucurbitacin D濃度增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng),胃癌AGS、SUN1、Hs746T細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度及NO含量均逐漸增加,且該作用呈明顯的濃度及時(shí)間依賴性(P0.05)。2.Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,隨著Cucurbitacin D濃度增加,胃癌AGS細(xì)胞中iNOS、Bax、Cleaved caspase-9及cytochrome蛋白表達(dá)量明顯增多,同時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯減低(P0.05);此外,Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,隨Cucurbitacin D濃度增加,胃癌AGS細(xì)胞Akt、mTOR及rs6的蛋白磷酸化水平明顯降低(P0.05)。為進(jìn)一步探討Cucurbitacin D抑制胃癌細(xì)胞增殖及促凋亡作用的潛在機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)分別應(yīng)用L-canavanine及SC79干預(yù)胃癌AGS細(xì)胞iNOS的表達(dá)及Akt的活化,設(shè)置對(duì)照組、Cucurbitacin D組、SC79組、Cucurbitacin D+SC79組、L-canavanine組、Cucurbitacin D+L-canavanine共六組;體外增殖與凋亡相關(guān)實(shí)驗(yàn)CCK-8法、TUNEL染色結(jié)果共同表明,與正常對(duì)照組及Cucurbitacin D組相比,Akt激活劑SC79可顯著消除Cucurbitacin D對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的體外增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用;同樣地,與正常對(duì)照組及Cucurbitacin D組相比,iNOS抑制劑L-canavanine也可拮抗Cucurbitacin D對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的體外增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用;構(gòu)建胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,隨機(jī)分為對(duì)照組、Cucurbitacin D組、SC79組、Cucurbitacin D+SC79四組,觀察并記錄裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的長(zhǎng)徑(L)及短徑(W),按公式V(mm~3)=LW~2×0.5236計(jì)算瘤體體積并繪制裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)曲線,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Cucurbitacin D可明顯抑制瘤體的生長(zhǎng),而SC79可拮抗該抑制作用(P0.05)。瘤體組織包埋、切片后進(jìn)行TUNEL染色,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,Cucurbitacin D處理組移植瘤胃癌的棕黃色凋亡細(xì)胞更多,凋亡細(xì)胞比例更高(P0.05),而SC79處理后阻斷了Cucurbitacin D對(duì)瘤體胃癌細(xì)胞的促凋亡作用(P0.05)。結(jié)論Cucurbitacin D在體內(nèi)外均具有一定的抗胃癌作用;Cucurbitacin D可干擾iNOS表達(dá)及Akt的活化、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS、Ca~(2+)的蓄積,增加細(xì)胞內(nèi)ATP及NO的含量,通過(guò)影響iNOS/NO信號(hào)通路及Akt信號(hào)通路發(fā)揮抗胃癌作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

引 言amycin, mTOR）等相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)水平，并用抑制劑干擾 iNOS 和表達(dá)與活化后檢測(cè)它們對(duì)葫蘆素 D 抗胃癌作用的影響；在體實(shí)驗(yàn)選擇裸移植瘤模型用于檢測(cè)葫蘆素 D 對(duì)胃癌體內(nèi)增殖和凋亡作用的影響。上述在明確葫蘆素 D 在體內(nèi)外具有抗胃癌作用，并探討了其可能的機(jī)制。

圖 2.1 CCK-8 法檢測(cè) Cucurbitacin D 對(duì)胃癌 AGS、SUN1、Hs746T 細(xì)胞增殖的抑制作用選用 5 個(gè)不同濃度梯度的 Cucurbitacin D（0.25、0.5、1、1.5、2μm）及 4 個(gè)不同刺激時(shí)間梯度（12、24、48、72h）對(duì)不同胃癌細(xì)胞株 AGS 細(xì)胞株（圖 2.1A）、SUN1 細(xì)胞株（圖2.1B）和 Hs746T 細(xì)胞株（圖 2.1C）細(xì)胞增殖的影響。*表示與對(duì)照組（0μm）比較，P＜0.05。2.2 Cucurbitacin D 對(duì)胃癌細(xì)胞內(nèi) ROS 水平的影響應(yīng)用 DCFH-DA 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) ROS 含量，其原理如下：DCFH-DA 為氧化敏感型熒光探針（無(wú)自發(fā)熒光），可穿過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)入胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)酯酶的水解作用下生成為 DCFH，生成的 DCFH 同樣自身無(wú)熒光但無(wú)法穿過(guò)胞膜，因此DCFH 聚集在胞內(nèi)，在胞內(nèi) ROS 的作用下發(fā)生氧化作用，生成 DCF，DCF 則是有熒光的。所以，細(xì)胞內(nèi) ROS 水平的含量，可以通過(guò)檢測(cè)到的 DCF 熒光的強(qiáng)弱得到直觀的反應(yīng)，熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀均可用于檢測(cè)。有研究表明，增加細(xì)胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生是 Cucurbitacin 家族發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。本部分研究中即通過(guò) DCFH-DA 檢測(cè)不同濃度 Cucurbitacin D 對(duì)胃癌 AGS、SUN1、Hs746T 細(xì)胞內(nèi) ROS 水平的影響。六孔板內(nèi)放入細(xì)胞爬片培養(yǎng)

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