【摘要】：根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的報(bào)告,抑郁癥是全人類(lèi)最流行的精神疾病之一,伴隨著的癥狀包括情緒低落、動(dòng)機(jī)減弱、失去興趣或快樂(lè)、自殺想法和無(wú)望等,截止2016年全世界所有年齡段的患病人數(shù)超過(guò)3.5億�？挂钟羲幬镆褟V泛用于治療抑郁癥,并在臨床指南中被推薦為中、重度抑郁癥發(fā)作的首選治療方法。但是,抗抑郁藥僅可使約50%左右的重度抑郁癥患者的癥狀得到完全緩解,且有副作用,如鎮(zhèn)靜和體重增加。雖然單胺類(lèi)系統(tǒng)(包括5-羥色胺,去甲腎上腺素和多巴胺系統(tǒng))長(zhǎng)期以來(lái)一直是抑郁癥研究和治療的焦點(diǎn),但新的治療靶點(diǎn)和藥物的開(kāi)發(fā)業(yè)已成為目前重要的探索方向之一。越來(lái)越多的證據(jù)表明,誘導(dǎo)抑郁癥的最重要的兩個(gè)因子慢性應(yīng)激和心理創(chuàng)傷均可損傷神經(jīng)元。保護(hù)神經(jīng)元免受損傷可能為未來(lái)抑郁癥的防治提供新的藥物靶點(diǎn)。在我國(guó),多酚類(lèi)中草藥的臨床應(yīng)用已有數(shù)千年歷史。多酚通常容易被胃腸道吸收并迅速穿過(guò)血腦屏障。丹皮酚(Paeonol,2'-羥基-4'-甲氧基苯乙酮,C_9H_(10)O_3)是一種典型的多酚物質(zhì),是從著名的牡丹皮中提取的酚酸化合物。已經(jīng)確定的是,丹皮酚具有多種臨床治療效果。近期的研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚應(yīng)用能減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為,但其細(xì)胞分子機(jī)制仍然知之甚少。因此,在本研究中,我們運(yùn)用丹皮酚治療慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁癥動(dòng)物模型,旨在進(jìn)一步理解其作用的細(xì)胞分子機(jī)制,為開(kāi)發(fā)潛在的防治抑郁癥新的藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在本研究中,我們通過(guò)慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(CUMS)誘導(dǎo)大鼠抑郁癥模型。用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT)、高十字架迷宮實(shí)驗(yàn)(EPMT)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST)和糖水偏好實(shí)驗(yàn)(SPT)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià),分析丹皮酚對(duì)CUMS誘導(dǎo)的自主探究活動(dòng)性下降、焦慮情緒、快感缺失等方面的影響。同時(shí)運(yùn)用Golgi-cox染色結(jié)合Sholl分析軟件、ImageJ軟件和RECONSTRUCT三維重建軟件,分析丹皮酚對(duì)CUMS誘導(dǎo)的大腦神經(jīng)元樹(shù)突的形態(tài)變化包括樹(shù)突長(zhǎng)度、樹(shù)突分支數(shù)目和棘突密度變化的影響;并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)、western blot實(shí)驗(yàn)來(lái)探究丹皮酚對(duì)CUMS誘導(dǎo)的腦部相關(guān)區(qū)域神經(jīng)元損傷的潛在的分子機(jī)制。結(jié)果如下:1.丹皮酚可以阻止CUMS誘導(dǎo)的大鼠行為學(xué)損傷。慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激導(dǎo)致大鼠在曠場(chǎng)試驗(yàn)中顯示出較低的活性和較少的穿越水平格數(shù)(兩者均為P0.05),在高架十字迷宮試驗(yàn)中在開(kāi)放臂中花費(fèi)的時(shí)間較少(P0.05),在蔗糖偏好試驗(yàn)中蔗糖消耗量較少(P0.05),強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間增多(P0.01)。在曠場(chǎng)試驗(yàn)中,對(duì)照組和氟西汀治療組(P0.05)或CUMS組和高劑量丹皮酚治療組的活性也有顯著差異(P0.05);在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中,CUMS組與氟西汀治療組(P0.01)、與低劑量丹皮酚治療組(P0.001)或與高劑量丹皮酚治療組(P0.01)差異顯著;在蔗糖偏好測(cè)試中的蔗糖消耗量,CUMS組與氟西汀治療組(P0.05)或CUMS組和高劑量丹皮酚治療組之間(P0.05)差異顯著。這些數(shù)據(jù)表明,丹皮酚治療顯著減弱CUMS誘導(dǎo)的行為損害。2.丹皮酚可顯著緩解CUMS誘導(dǎo)的大鼠相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)元損傷。在本研究中,我們對(duì)內(nèi)側(cè)額葉、杏仁核、海馬和伏隔核等相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突的長(zhǎng)度和分支數(shù)、神經(jīng)元樹(shù)突棘的密度和類(lèi)型百分比進(jìn)行了詳細(xì)的研究。其中,在同一神經(jīng)元上,我們對(duì)神經(jīng)元的頂樹(shù)突和總樹(shù)突長(zhǎng)度分別進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),對(duì)不同節(jié)段上樹(shù)突分支與同心圓交叉點(diǎn)數(shù)分別進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),對(duì)不同區(qū)域位置即基樹(shù)突區(qū)域、頂樹(shù)突近胞體端和遠(yuǎn)胞體區(qū)域的樹(shù)突棘密度和類(lèi)型百分比分別進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。同時(shí)根據(jù)測(cè)量的樹(shù)突棘的大小,由RECONSTRUCT三維重建軟件對(duì)激光共聚焦三維圖像進(jìn)行分析,將樹(shù)突棘自動(dòng)分為三種類(lèi)型:絲/線(xiàn)型(長(zhǎng)度1μm或長(zhǎng)寬比1)、短棒型(ST,長(zhǎng)寬比≤1以及長(zhǎng)度1μm)和蘑菇/分支型(MB,寬度0.6μm或形態(tài)“分支狀”)。分析結(jié)果不難看出,慢性應(yīng)激可以普遍誘導(dǎo)各腦區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突長(zhǎng)度變短、樹(shù)突分支數(shù)減少,樹(shù)突棘密度降低,而氟西汀或丹皮酚的使用則可阻止或減緩這些改變。但從棘突的不同類(lèi)型來(lái)分析,可以發(fā)現(xiàn),慢性應(yīng)激對(duì)不同腦區(qū)影響雖有所不同,但總的來(lái)說(shuō)對(duì)不同的棘突類(lèi)型影響的結(jié)果是不一樣的:較為一致的現(xiàn)象是,慢性應(yīng)激可降低蘑菇或分支狀型棘突的密度,但卻往往伴隨著增加絲/線(xiàn)型棘突的密度;同樣氟西汀或丹皮酚的使用則可阻止或減緩這些變化趨勢(shì)。因此,Paeonol緩解慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)元的損傷,可能主要是通過(guò)減少神經(jīng)元樹(shù)突的丟失,增加功能性樹(shù)突棘——蘑菇/分支型棘突的密度,進(jìn)而緩解相應(yīng)的行為學(xué)表現(xiàn)。3.丹皮酚處理可有效緩解CUMS誘導(dǎo)的cofilin1的活性紊亂以及在神經(jīng)元中的重新分布。cofilin1是組成神經(jīng)元樹(shù)突棘骨架的肌動(dòng)蛋白細(xì)絲重塑最重要的調(diào)節(jié)因子之一,可通過(guò)對(duì)其Ser3位點(diǎn)去磷酸化或從結(jié)合于膜蛋白上釋放入胞質(zhì)而激活。cofilin1的過(guò)度激活或失活均可導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白重塑以及樹(shù)突和突觸的丟失。我們的結(jié)果顯示,慢性應(yīng)激誘導(dǎo)了cofilin1水平在mPFC和海馬增加,而在杏仁核減少;誘導(dǎo)了p-cofilin1水平在杏仁核和伏隔核中增加,在mPFC中減少,而在海馬中則沒(méi)有顯著變化;同時(shí)還在一些腦區(qū)如海馬誘導(dǎo)cofilin1增加在胞質(zhì)中的分布。這些變化,通常會(huì)在氟西汀或丹皮酚處理后得以緩解。這暗示,cofilin1的激活或失活多是通過(guò)改變其表達(dá)水平和磷酸化修飾,也有通過(guò)調(diào)節(jié)與膜蛋白的結(jié)合,另一方面cofilin1的激活或失活在不同腦區(qū)是不一樣的,具有腦區(qū)特異性;可能正是cofilin1活性的改變,影響了actin的重塑,進(jìn)而改變了樹(shù)突和樹(shù)突棘的形態(tài)。4.丹皮酚處理可顯著緩解CUMS誘導(dǎo)的Rho GTPase(Rac1,CDC42和RhoA)水平改變。Rho GTPase作為分子開(kāi)關(guān),可以介導(dǎo)多種胞內(nèi)外信號(hào)分子,通過(guò)多種信號(hào)通路作用下游靶蛋白,包括cofilin1。我們的數(shù)據(jù)顯示,慢性應(yīng)激普遍改變了GTPase的表達(dá)水平:降低了mPFC的Rac1和RhoA水平,增加了杏仁核和海馬的Rac1和Rho A水平,降低了伏隔核的Rac1水平,卻增加了伏隔核的CDC42和RhoA水平。不同濃度的丹皮酚或氟西汀的使用多數(shù)都能緩解上述開(kāi)關(guān)分子的改變。這樣的結(jié)果提示,GTPase-cofilin1信號(hào)通路可能參與了Paeonol緩解慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元樹(shù)突棘丟失和樹(shù)突萎縮的生理過(guò)程。我們的結(jié)果還提示,在一些腦區(qū)如海馬BDNF可能通過(guò)TrKB受體介導(dǎo)影響GTPase-cofilin1信號(hào)通路。5.丹皮酚可顯著緩解CUMS誘導(dǎo)的某些腦區(qū)GSK3β和calcineurin(CaN)表達(dá)水平的變化。研究顯示,GSK3β和calcineurin可能參與慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的cofilin1改變和行為損傷。我們的結(jié)果揭示,在一些腦區(qū),如在杏仁核,慢性應(yīng)激降低了CaN水平,丹皮酚的使用(高或低劑量)均可阻止其下降;慢性應(yīng)激卻提高了GSK3β的水平,但高劑量丹皮酚或氟西汀的處理卻可以緩解GSK3β水平的提高。這說(shuō)明,CaN和GSK3β在某些腦區(qū)如杏仁核也參與了Paeonol緩解慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元樹(shù)突棘丟失和樹(shù)突萎縮的生理過(guò)程。綜上所述,丹皮酚可顯著減輕慢性應(yīng)激誘發(fā)的行為損傷。這些行為的損傷可能與相關(guān)腦區(qū)的樹(shù)突棘丟失和樹(shù)突萎縮存在因果關(guān)系。與這些樹(shù)突形態(tài)改變一致的是cofilin1活性的紊亂,伴隨著不同腦區(qū)Rho GTPase表達(dá)水平的改變,以及BDNF和/或GSK3β/calcineurin的改變。上述紊亂或改變多可由丹皮酚處理得到緩解。我們的數(shù)據(jù)暗示,丹皮酚在不同腦區(qū)可以通過(guò)GTPase-cofilin1或GSK3β/calcineurin等多種信號(hào)通路減弱CUMS誘導(dǎo)的突觸和樹(shù)突損失,并最終改善行為缺陷。我們的實(shí)驗(yàn)也提示丹皮酚可能是治療抑郁癥的潛在藥物。
【學(xué)位授予單位】：安徽師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
【圖文】：

圖 1.上圖表示一個(gè)棘的放大。下圖為來(lái)自大鼠腦的不同多棘神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)。大腦皮質(zhì)層II/III 的錐體神經(jīng)元（A）；CA1（B），CA3（C）海馬區(qū);內(nèi)嗅皮質(zhì)層 II/III（D）; 來(lái)自紋狀體的中等棘神經(jīng)元（E）以及來(lái)自這些相應(yīng)區(qū)域（F-J）的樹(shù)突棘的形態(tài)。Golgi-Cox 染色所揭示的。（K）-（N）為培養(yǎng) 21 天后 DiI 染色的海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元及其樹(shù)突棘圖像。（O）表示一個(gè)典型的樹(shù)突上各類(lèi)型棘分支（注意：不同的參數(shù)，包括總樹(shù)突長(zhǎng)度，樹(shù)突直徑，棘面積，棘長(zhǎng)度和棘頭部和頸部直徑被測(cè)量）。圖截取自文獻(xiàn)(Maiti, Manna, Ilavazhagan,Rossignol, & Dunbar, 2015)Fig. 1 The figure above showed an enlarged spine. The figure below showed the morphologyof different spiny neurons from rat brain. Pyramidal neurons from layer-II/III of cerebralcortex (A); CA1 (B), CA3 (C) regions of hippocampus, layer-II/III of entorhinal cortex (D);medium spiny neuron from the striatum (E), and the morphology of dendritic spines fromtheses respective regions (F J) as revealed by Golgi Cox stain. (K) (N) Images ofhippocampal and cortical neurons and their dendritic spines stained by DiI after 21 days inculture. (O) schematic diagram of a typical dendritic branch with spines (Note: Differentparameters, including total dendritic length, dendritic diameter, spine area, spine length andspine head and neck diameter are measured to study spine pathology). These figures werecut from the literature:(Maiti et al., 2015) .在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，樹(shù)突棘的結(jié)構(gòu)和功能并不固定，不斷變化表現(xiàn)出不同樹(shù)

1.1.4 分組動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，用 Open-field 行為學(xué)評(píng)分，選擇評(píng)分相近的動(dòng)物，將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Co）、抑郁癥模型組(chronic unpredictable mild stress，CUMS,Cu）、氟西汀組（Fl，10mg / kg，ig）、丹皮酚低劑量組（Pl，25mg / kg，ig）和丹皮酚高劑量組（Ph，80mg / kg，ig）。正常對(duì)照組每籠飼養(yǎng) 6 只，共 36只；抑郁癥模型組、氟西汀組、丹皮酚低劑量組和丹皮酚高劑量組每籠飼養(yǎng) 1 只( 分養(yǎng)) 共 144 只。在 CUMS 誘導(dǎo)后一周，每日在 CUMS 前 1 小時(shí)給予氟西汀或丹皮酚 4 周。Co 的預(yù)處理是體積匹配的生理鹽水。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 許蘭芝;赫明揚(yáng);戴功;冷平;;丹皮酚對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子水平的干預(yù)作用[J];中國(guó)臨床康復(fù);2005年39期

本文編號(hào)：2715000