發(fā)布時(shí)間：2020-06-15 14:48

【摘要】：1研究目的1.1研究水蛭生品、滑石粉燙制品、酒炙品抗凝血活性差異,為水蛭的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。1.2研究炮制對水蛭蛋白的影響,采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析主要的差異蛋白,為水蛭生品及其炮制品的藥效物質(zhì)研究提供參考依據(jù)。1.3研究炮制對水蛭表面真菌的影響,找出水蛭生品及其炮制品表面的優(yōu)勢菌群,為水蛭的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。2研究內(nèi)容與研究方法2.1樣品收集在河北安國藥材市場收集清水吊干水蛭藥材10批,密封,4℃保存?zhèn)溆谩?.2水蛭炮制按照2015版《中國藥典》通則(0213)規(guī)定對水蛭藥材進(jìn)行酒炙和滑石粉燙制。2.3水蛭及其炮制品抗凝血活性檢測按照2015版《中國藥典》水蛭含量測定項(xiàng)下規(guī)定的滴定法及活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)對水蛭生品及其炮制品的抗凝血活性進(jìn)行評價(jià)。2.4水蛭生品及其炮制品蛋白質(zhì)檢測2.4.1SDS-PAGE法初步探究水蛭生品及其炮制品的蛋白差異利用SDS-PAGE凝膠電泳技術(shù)對水蛭生品及其炮制品的蛋白差異進(jìn)行初步分析。2.4.2Label free法蛋白組學(xué)分析使用蛋白裂解液對蛋白進(jìn)行提取,通過BCA法對提取的蛋白進(jìn)行定量分析,對質(zhì)量達(dá)標(biāo)的蛋白進(jìn)行還原烷基化處理,隨后進(jìn)行Trypsin酶解,對Trypsin酶解得到的肽段進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜分析。依據(jù)Label free技術(shù)將質(zhì)譜采集到的數(shù)據(jù)在水蛭蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索和匹配。分析水蛭生品及其炮制品的蛋白差異。2.5水蛭生品及其炮制品飲片表面真菌的培養(yǎng)與鑒定用無菌水沖洗水蛭生品及其炮制品飲片表面的真菌,采用平板法培養(yǎng)真菌。將得到的真菌進(jìn)行分離、純化。結(jié)合真菌菌落形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)、DNA條形碼技術(shù)共同鑒定水蛭飲片表面真菌種類。統(tǒng)計(jì)水蛭生品及其炮制品藥材表面真菌數(shù)目及種類,找出主要污染菌。2.6基于Illumina HiSeq 2500測序平臺(tái)分析水蛭表面真菌多樣性對水蛭生品及其炮制品表面真菌DNA進(jìn)行提取,以ITS1序列為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,質(zhì)檢合格的樣品用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測序。測序得到的原始序列,經(jīng)過堿基識別,形成原始的測序序列,得到雙端Reads(PE reads),拼接雙端reads得到原始序列數(shù)(Raw Tags),原始序列過濾、去除嵌合體后得到有效序列數(shù)(Effective Tags)。使用質(zhì)控過后的有效序列(Effective Tags)劃分操作分類單元,進(jìn)行物種注釋。獲得各樣品在界、門、綱、目、科、屬、種分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)組成,分析水蛭飲片表面真菌種類的多樣性。3研究結(jié)果3.1水蛭抗凝血活性檢測通過2015版《中國藥典》規(guī)定的滴定法檢測發(fā)現(xiàn)水蛭生品及其炮制品抗凝血活性滿足藥典規(guī)定的3.0U。水蛭生品與炮制品對活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)有顯著的延長作用,對凝血酶原(PT)時(shí)間影響較小。結(jié)合滴定法和體外檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)水蛭生品抗凝血活性最好,酒炙品次之,滑石粉燙制品的抗凝血活性最弱。3.2水蛭生品及其炮制品蛋白差異分析SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示,蛋白裂解液提取的蛋白條帶個(gè)數(shù)最多且較為清晰。水蛭生品與炮制品在蛋白質(zhì)的條帶顏色和數(shù)量上均存在較為明顯的差異,生品較為清晰的條帶個(gè)數(shù)約有11條,顏色較深。酒炙品較為清晰的條帶約有7個(gè),顏色較淺�；蹱C制品較為清晰的條帶個(gè)數(shù)約有5-7個(gè)。表明水蛭在炮制過程中蛋白發(fā)生了降解。水蛭酒炙品與水蛭生品搜庫得到的蛋白質(zhì)相比較,差異蛋白質(zhì)中增加的為6個(gè),下降的為72個(gè)。水蛭滑石粉燙制品與水蛭生品搜庫得到的蛋白質(zhì)相比較,差異蛋白質(zhì)中增加的為6個(gè),下降的為192個(gè)。表明生品與酒炙品的蛋白表達(dá)更為接近。3.3水蛭生品及其炮制品表面真菌污染情況及多樣性分析對水蛭生品表面真菌進(jìn)行培養(yǎng)共得到12種真菌,數(shù)量無法計(jì)數(shù)。對水蛭酒炙品表面真菌進(jìn)行培養(yǎng)共得到15種,154株真菌。對水蛭滑石粉燙制品表面真菌進(jìn)行培養(yǎng)共得到18種,107株真菌。水蛭表面真菌以曲霉屬、青霉屬、鏈格孢屬、枝孢屬為主。高通量測序結(jié)果顯示,水蛭表面真菌多樣性酒炙品滑石粉燙制品生品。真菌種類與平板法結(jié)果相似。4結(jié)論4.1綜合滴定法以及體外抗凝血活性研究發(fā)現(xiàn)水蛭抗凝血活性水蛭生品優(yōu)于炮制品,酒制品的抗凝血活性略高于滑石粉燙制品。4.2綜合SDS-PAGE與Label free結(jié)果,水蛭生品經(jīng)過炮制后蛋白含量減少,但是炮制品仍有抗凝血活性,表明水蛭生品炮制過中大分子蛋白質(zhì)變成具有抗凝血活性的小分子蛋白或肽段。4.3綜合平板法及高通量測序結(jié)果,水蛭炮制品表面真菌種類多于生品,水蛭表面真菌主要來自青霉屬和曲霉屬。5創(chuàng)新點(diǎn)5.1首次利用Label free技術(shù)對水蛭生品及其炮制品的蛋白組學(xué)進(jìn)行研究,從蛋白層面分析水蛭生品與炮制品的藥效差異。5.2首次利用Illumina Hiseq平臺(tái)對水蛭生品及其炮制品表面真菌進(jìn)行高通量測序,并對其表面多樣性進(jìn)行評估。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R283
【圖文】：

圖１實(shí)驗(yàn)流程圖逡逑

圖２－１水蛭生品及其炮制品抗凝血酶效價(jià)柱狀圖逡逑水蛭生品及其炮制品的凝血酶滴定結(jié)果顯示，水蛭生品、酒炙品、滑石粉燙制血活性的均值分別為４．６７邋Ｕ、３．５４邋Ｕ、３．２９邋Ｕ，符合藥典規(guī)定。生品的抗凝血活于酒炙品和滑石粉燙制品。利用ＳＡＳ軟件對方差進(jìn)行分析，結(jié)果顯示水蛭生品、逡逑

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本文編號：2714571