【摘要】：目的:內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ),本研究通過(guò)對(duì)動(dòng)物腹腔注射LPS誘導(dǎo)“熱毒血瘀”型內(nèi)皮損傷模型的研究以及給藥Aspirin后的病理改變的探討,從中西醫(yī)兩方面評(píng)價(jià)Aspirin對(duì)“熱毒血瘀”型內(nèi)皮損傷模型的治療作用。用中醫(yī)基礎(chǔ)理論解釋LPS誘導(dǎo)“熱毒血瘀”的病因以及Aspirin的治療機(jī)制,并為以后以中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究西醫(yī)西藥或指導(dǎo)西醫(yī)西藥治病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)臨床問(wèn)卷調(diào)查尋找血瘀癥生物指標(biāo),并通過(guò)誘導(dǎo)“熱毒血瘀”證動(dòng)物模型驗(yàn)證相關(guān)生物指標(biāo):根據(jù)早期文獻(xiàn)查閱,制作“關(guān)于對(duì)心血管疾病相關(guān)中醫(yī)證型的臨床指標(biāo)差異性調(diào)查問(wèn)卷”。邀請(qǐng)?jiān)擃I(lǐng)域內(nèi)的醫(yī)生和學(xué)者進(jìn)行問(wèn)卷回答,根據(jù)醫(yī)生及學(xué)者的回答,分析統(tǒng)計(jì)出符合血瘀型心血管疾病的生物指標(biāo)。確定好血瘀癥的生物指標(biāo)后,通過(guò)“熱毒血瘀”型動(dòng)物模型驗(yàn)證相應(yīng)指標(biāo)。腹腔注射LPS誘導(dǎo)“熱毒血瘀”型內(nèi)皮損傷。采用隨機(jī)分組原則將24只大鼠隨機(jī)分為3組,即正常組、低劑量模型組以及高劑量模型組,每組8只大鼠。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的1-7天采用腹腔注射方式,分別給予生理鹽水、100μg/kg LPS和30μg/kg LPS溶液。觀察動(dòng)物狀態(tài)、飲食及體重變化。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第8天開(kāi)始取材。腹腔主動(dòng)脈取血,血液一部分用來(lái)檢測(cè)血液流變學(xué)指標(biāo),如全血還原粘度、紅細(xì)胞積壓、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、血沉以及纖維蛋白原;另一部分取血清用來(lái)檢測(cè)各種試劑盒,如TG、TC、Apo-A、Apo-B、SOD、LPO、TXB2和6-keto-PGF1α等;取胸主動(dòng)脈做免疫熒光,檢測(cè)血管內(nèi)皮層中VE-Cadherin、ZO1等連接蛋白構(gòu)成的血管內(nèi)皮細(xì)胞層的完整性。(2)Aspirin治療LPS誘導(dǎo)“熱毒血瘀”型內(nèi)皮損傷的藥效學(xué)研究:利用LPS(2μg/mL)刺激小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞造成炎癥模型,采用不同濃度的Aspirin干預(yù)細(xì)胞。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、LPS 造模組、0.1 mmol/L、0.5mmol/L、1 mmol/L、2mmol/L和3mmol/LAspirin組以及地塞米松陽(yáng)性藥對(duì)照組。刺激劑與藥物孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)后開(kāi)始試驗(yàn)。MTT、LDH及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性,篩選出藥物的濃度;免疫熒光檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白201/Z02的表達(dá),內(nèi)皮細(xì)胞膜滲透性檢測(cè)和跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻檢測(cè)一起判斷內(nèi)皮細(xì)胞膜的破損情況,檢測(cè)一氧化氮的釋放量以此判斷內(nèi)皮細(xì)胞功能的變化。將48只C57BL/6小鼠采用隨機(jī)分組原則分為正常對(duì)照組(Control),模型組(LPS組),陽(yáng)性藥組(Dexamethasone,0.0182mg/kg),低劑量 Aspirin 組(12.5mg/kg),中劑量 Aspirin 組(62.5mg/kg)以及高劑量阿 Aspirin 組(125mg/kg)。LPS 采用 100μg/kg的濃度造模。連續(xù)干預(yù)7天,第8天處死小鼠并取材。將小鼠的心臟冰凍切片為8μm厚的薄片,冷凍保存。采用免疫熒光共定位的方法檢測(cè)小鼠心臟微循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的完整性:VWF/ZO1,VWF/ZO2。(3)Aspirin治療LPS誘導(dǎo)“熱毒血瘀”型內(nèi)皮損傷的機(jī)制研究:利用LPS(2μg/mL)刺激小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞造成炎癥模型,采用不同濃度的Aspirin干預(yù)細(xì)胞。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、LPS 造模組、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2mmol/L Aspirin組。刺激劑與藥物孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)后開(kāi)始試驗(yàn)。細(xì)胞內(nèi)ROS被DCFH-DA探針染上熒光后由細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測(cè)顯微鏡檢測(cè);ROS的釋放量,Western Blot檢測(cè)的TXNIP蛋白的表達(dá)量以及免疫熒光共定位TXNIP/NLRP3的結(jié)果共同確定NLRP3炎癥小體的形成與活化和ROS/TXNIP信號(hào)通路有關(guān)。Westem Blot檢測(cè)NLRP3、ASC、Caspase-1、HMGB1和RAGE蛋白的表達(dá)以及免疫熒光共定位NLRP3/ASC,NLRP3/Caspase-1,以此判定炎癥小體的形成和活化情況。shRNA沉默RAGE以及gRNA沉默NLRP3表達(dá)后檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白的表達(dá),確定Aspirin改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙與NLRP3炎癥小體活化后所激活的HMGB1-RAGE軸密切相關(guān)。運(yùn)用前期冰凍保存的小鼠心臟冰凍切片,采用免疫熒光共定位的方法檢測(cè)小鼠切片中心臟微循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的形成與活化:NLRP3/Caspase-1、VWF/HMGB1。酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)一步測(cè)定小鼠血清中HMGB1的含量。結(jié)果:(1)臨床問(wèn)卷調(diào)查尋找生物指標(biāo),并通過(guò)動(dòng)物模型驗(yàn)證相關(guān)生物指標(biāo)與動(dòng)物模型的對(duì)應(yīng)性:對(duì)調(diào)查問(wèn)卷進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,“熱毒血瘀”型心血管疾病的生物指標(biāo)的選擇有:血液流變學(xué)指標(biāo),血脂代謝指標(biāo)TG、TC,載脂蛋白代謝指標(biāo)Apo-A、Apo-B,TXA2-PGI2相對(duì)平衡指標(biāo)TBX2和6-keto-PGF1α,氧自由基體系指標(biāo)SOD和LPO等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),全血還原粘度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和血沉在LPS刺激下明顯升高,且呈濃度依賴性增加;紅細(xì)胞積壓變化不明顯。檢測(cè)到的纖維蛋白原的變化也在LPS刺激下呈劑量依賴性的增加。LPS刺激下血清中TG、TC的含量升高,但高劑量LPS的刺激沒(méi)有低劑量LPS刺激下增長(zhǎng)的多;Apo-B/Apo-A的比值隨著LPS劑量的增加比值逐步升高。SOD酶的活性在低劑量LPS的刺激下被激活,高劑量的LPS刺激下SOD酶的活性也有所增加,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;LPO在LPS的刺激下含量升高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6-keto-PGF1α和TXB2的表達(dá)量在LPS刺激下含量增加,6-keto-PGF1α的含量時(shí)隨LPS劑量的增加而增多,TXB2的表達(dá)量在低劑量LPS刺激時(shí)最高,高劑量LPS刺激時(shí)的含量會(huì)比低劑量的含量少;但是TXB2/6-keto-PGF1α的比值卻隨著LPS劑量的增加而減小。隨著給藥LPS劑量的增加,內(nèi)皮層連接蛋白VE-Cadherin、ZO1的完整性遭到破壞,且破壞程度越來(lái)越嚴(yán)重,破壞區(qū)域越來(lái)越多。(2)Aspirin治療LPS誘導(dǎo)“熱毒血瘀”型內(nèi)皮損傷的藥效學(xué)研究:對(duì)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行MTT和LDH實(shí)驗(yàn),檢測(cè)所選LPS濃度、Aspirin濃度以及地塞米松對(duì)細(xì)胞的低毒性,其中認(rèn)為3 mmol/L Aspirin對(duì)細(xì)胞具有毒性。運(yùn)用細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,LPS、2mmol/L和3mmol/LAspirin會(huì)抑制細(xì)胞增殖,3mmol/LAspirin是明顯抑制,而其他濃度Aspirin能恢復(fù)細(xì)胞的增殖,所以認(rèn)為高濃度Aspirin,即3mmol/L對(duì)細(xì)胞有毒性,因此將該濃度舍棄。接下來(lái)檢測(cè)內(nèi)皮功能變化,發(fā)現(xiàn)LPS刺激后連接蛋白破損,細(xì)胞膜通透性增大,細(xì)胞電阻變小,一氧化氮釋放量減少,這些說(shuō)明了內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂;給藥Aspirin后情況得到好轉(zhuǎn),連接蛋白的表達(dá)得到修復(fù),細(xì)胞膜通透性得到改善,細(xì)胞電阻得到回升,一氧化氮釋放量明顯增多,說(shuō)明了 Aspirin的有效性,且效果隨濃度的增加而越來(lái)越明顯;但給藥地塞米松后,內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂沒(méi)有得到改善。對(duì)小鼠心臟切片進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),發(fā)現(xiàn)LPS的刺激會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮緊密連接蛋白Z01/Z02的表達(dá)量明顯降低;地塞米松干預(yù)能使緊密連接蛋白得到恢復(fù);低濃度和高濃度Aspirin干預(yù)后的Z01/Z02的表達(dá)也得到了修復(fù),但中濃度Aspirin對(duì)恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接蛋白沒(méi)有起到恢復(fù)作用。(3)Aspirin治療LPS誘導(dǎo)“熱毒血瘀”型內(nèi)皮損傷的機(jī)制研究:細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測(cè)顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS,LPS刺激會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)ROS的釋放,Aspirin干預(yù)可以抑制ROS的釋放 Western Blot檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的TXNIP、NLRP3、Caspase-1、HMGB1等蛋白的表達(dá)量變化,發(fā)現(xiàn)LPS刺激會(huì)增加這些蛋白的表達(dá)量,而Aspirin干預(yù)可以抑制蛋白的表達(dá)。但ASC表達(dá)量在LPS刺激和Aspirin干預(yù)情況下均不變,但用免疫熒光共定位的方法檢測(cè)TXNIP/NLRP、NLRP3/ASC和NLRP3/Caspase-1的募集情況就會(huì)發(fā)現(xiàn),LPS 刺激會(huì)增加 TXNIP/NLRP3,NLRP3/ASC,NLRP3/Caspase-1 的共定位區(qū)域,而給藥Aspirin后共定位區(qū)域會(huì)減少。運(yùn)用shRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染RAGE以及運(yùn)用gRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染NLRP3后的內(nèi)皮細(xì)胞用來(lái)檢測(cè)檢測(cè)內(nèi)皮連接蛋白,發(fā)現(xiàn)無(wú)論是LPS刺激還是Aspirin干預(yù),其連接性無(wú)明顯變化。共染小鼠心臟冰凍切片NLRP3/Caspase-1,發(fā)現(xiàn)LPS刺激增加了共定位區(qū)域,并且地塞米松、中濃度Aspirin的干預(yù)不能減少兩種熒光之間的共染,低濃度和高濃度Aspirin均能減少兩種熒光間的共定位;共染VWE/HMGB1也得到同樣的結(jié)果。Elisa試劑盒檢測(cè)小鼠血清中HMGB1含量,低濃度Aspirin能減少HMGB1在血清中含量,但其余兩種濃度的Aspirin無(wú)抑制作用,地塞米松卻能有效的降低血清中HMGB1的含量。結(jié)論:1.LPS成功誘導(dǎo)“熱毒血瘀”型內(nèi)皮損傷模型2.Aspirin可通過(guò)恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白功能而起到治療“熱毒血瘀”型內(nèi)皮損傷的治療作用3.Aspirin修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白的藥理作用與NLRP3炎癥小體信號(hào)通路密切相關(guān)
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
【圖文】：

．圖１．邋Ａｓｐｉｒｉｎ治療內(nèi)皮損傷假設(shè)通路圖逡逑義逡逑ＬＰＳ誘導(dǎo)“熱毒血瘀”型內(nèi)皮損傷模型逡逑化應(yīng)激誘導(dǎo)ＮＬＲＰ３炎癥小體活化的信號(hào)通路機(jī)制出發(fā)，檢測(cè)ＡｓｐｉｒｉｎＮＬＲＰ３，Ａｉｒ

邐ｉ逡逑Ｄａｙ邋２邋Ｄａｙ邋３邋Ｄａｙ邋４邋Ｄａｙ邋６逡逑圖１－１邋ＬＰＳ對(duì)“熱毒血瘀”證大鼠體重量、飲水X椓亢徒吃雋康謀浠撓跋戾義希疲椋紓酰潁澹澹保卞澹牛媯媯澹悖簦簀澹錚駑澹蹋校渝澹錚鑠澹攏錚洌澹鰨澹椋紓瑁簦ǎ粒澹祝幔簦澹蟈澹椋睿悖潁澹恚澹睿翦澹ǎ攏╁澹幔睿溴澹模椋澹翦澹椋睿悖潁澹恚澹睿翦澹ǎ茫╁義希錚駑澹潁幔簦簀澹鰨椋簦楨澹ⅲ危錚椋錚酰簀澹齲澹幔翦澹幔睿溴澹攏歟錚錚溴澹櫻簦幔螅椋蟆保澹模幔簦徨澹鰨澹潁邋澹澹穡潁澹螅螅澹溴澹幔簀澹恚澹幔鑠迨垮澹櫻牛�，邋？Χ．辶x希跡埃埃靛澹觶螅澹危錚潁恚幔戾澹紓潁錚酰皰澹ǎ埃穡紓耄紓╁義希常插澹蹋校喲碳ざ源笫筇迥諮毫鞅溲е副甑母謀溴義顯炷Ｗ楦蹋校喲碳ず�，发蠄�(zhí)笫蟮娜乖扯任蘼凼塹頹小⒅星謝故歉咔芯義顯齦

本文編號(hào)：2712859