發(fā)布時(shí)間：2020-06-13 23:01

【摘要】：目的:利用生物信息學(xué)技術(shù),使用數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合軟件快速對(duì)本課題組前期經(jīng)過(guò)ITRAQ篩選出的何首烏相關(guān)差異蛋白進(jìn)行基于本體論注釋的聚類分析,蛋白質(zhì)相互作用分析,同時(shí)使用經(jīng)內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的大鼠肝損傷炎癥模型,研究何首烏對(duì)該模型的肝損傷作用,并進(jìn)一步檢測(cè)膽汁淤積相關(guān)指標(biāo),從而為闡明何首烏肝毒性機(jī)制提供線索,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。方法:對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO聚類分析、蛋白質(zhì)互作分析、KEGG通路分析與Meta Core蛋白互作網(wǎng)絡(luò)富集分析。然后將136只體重為180-200 g的雄性SD大鼠分為以下5組:空白對(duì)照組(Ctrl)、LPS組(LPS)、LPS+對(duì)乙酰氨基酚(LPS+APAP)、何首烏組(AEP)和LPS+何首烏組(LPS+AEP)。并按動(dòng)物體重,尾靜脈注射給予LPS組、LPS+AEP組4 mg/kg LPS。2 h后灌胃給予AEP組和LPS+AEP組12 g/kg(相當(dāng)于臨床給藥劑量22倍)何首烏,每日一次,連續(xù)給藥7天建立特異質(zhì)肝損傷炎癥模型。觀察體重變化,進(jìn)行肝臟系數(shù)及組織病理學(xué)檢查,并分別取第2 h、14 h、5 d、8 d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)血生化肝功能相關(guān)指標(biāo)同時(shí)收集膽汁,計(jì)算膽汁流速與密度并檢測(cè)膽汁中主要成分變化。對(duì)膽汁淤積相關(guān)蛋白膽鹽輸出泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(BSEP)、多藥耐藥蛋白2(MRP2)及多藥耐藥蛋白3(MRP3)進(jìn)行Real-Time PCR檢測(cè)。結(jié)果:1.通過(guò)ITRAQ技術(shù)篩選找出17β-羥基固醇類脫氫酶2、碳酸酐酶同工酶、重組人蛋白酪氨酸磷酸酯酶非受體1型、細(xì)胞色素P450 2B1(CYP2B1)、60S核糖體蛋白L13、雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶2、線粒體ATP合成酶復(fù)合體亞基C1、超氧化物歧化酶2(SOD2)等36種蛋白質(zhì)作為潛在LPS激活何首烏肝損傷的生物標(biāo)志物,為何首烏肝毒性研究提供檢測(cè)和預(yù)防的檢查手段。進(jìn)一步對(duì)這些蛋白進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析,發(fā)現(xiàn)一些重要蛋白:尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶2b17(UGT2B17)、CYP2B13、CYP2C6、雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶2、17β-羥基固醇類脫氫酶2、60S核糖體蛋白L10、40S核糖體蛋白S23、超氧化物歧化酶2、谷胱甘肽還原酶、烯脂酰-Co A還原酶、�；o酶A硫酯酶5、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白10、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、線粒體導(dǎo)入受體亞基TOM6同族體、線粒體ATP合成酶復(fù)合體亞基C1。2.在差異蛋白的GO中,與細(xì)胞組成相關(guān)的有156條,與分子功能相關(guān)的有98條,與生物過(guò)程相關(guān)的有321條。3.經(jīng)過(guò)KEGG pathway分析,發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要參與甾類激素生物合成途徑、核糖體途徑、化學(xué)致癌途徑、視黃醇代謝途徑、原發(fā)性免疫缺陷途徑等。4.通過(guò)Meta Core對(duì)網(wǎng)絡(luò)分布進(jìn)行富集分析,我們發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要參與炎癥系統(tǒng)如IL2、IL6信號(hào)傳導(dǎo)通路、免疫相關(guān)信號(hào)如MHC家族相關(guān)的抗原呈遞途徑、抗原呈遞的吞噬小體信號(hào)通路、膽汁酸代謝調(diào)節(jié)、線粒體細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)等途徑。5.成功建立的經(jīng)LPS誘導(dǎo)的何首烏肝損傷SD大鼠模型;6.經(jīng)過(guò)LPS誘導(dǎo)2 h后LPS+AEP組與空白對(duì)照組、AEP組相比體重明顯下降,至8 d肝臟系數(shù)顯著增加(P0.05)。血清生化指標(biāo)顯示,LPS+AEP組ALT,AST水平無(wú)明顯變化。8 d的TBIL明顯降低(P0.05)而ALP升高(P0.05),LPS+AEP組可觀察到膽汁密度和膽汁流速明顯降低。對(duì)膽汁成分分析顯示TCHO升高,TBIL顯著降低(P0.05)。病理結(jié)果顯示AEP組出現(xiàn)輕微肝細(xì)胞變性,而LPS+AEP組可見(jiàn)嚴(yán)重局灶壞死。轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)后可使得BSEP、MRP2在14 h時(shí)出現(xiàn)短期抑制(P0.05),單獨(dú)給予AEP可使BSEP、MRP2和MRP3的表達(dá)水平顯著升高(P0.05,P0.01)。而LPS+AEP給藥第8 d對(duì)大鼠肝臟BSEP、MRP2無(wú)顯著性影響,但可使MRP3轉(zhuǎn)錄水平升高(P0.05)。結(jié)論:1.通過(guò)分析差異蛋白的GO注釋,發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要代謝、免疫、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞殺傷等方面來(lái)影響機(jī)體功能。2.通過(guò)蛋白質(zhì)互作分析發(fā)現(xiàn)了一些可能與肝毒性機(jī)制相關(guān)的差異蛋白,分別是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶2b17(UGT2B17)、CYP2B13、CYP2C6、雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶2、17β-羥基固醇類脫氫酶2、60S核糖體蛋白L10、40S核糖體蛋白S23、超氧化物歧化酶2、谷胱甘肽還原酶、烯脂酰-Co A還原酶、�；o酶A硫酯酶5、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白10、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、線粒體導(dǎo)入受體亞基TOM6同族體、線粒體ATP合成酶復(fù)合體亞基C1。根據(jù)分析結(jié)果推測(cè)可能與膽紅素代謝相關(guān)。3.通過(guò)KEGG pathway分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白參與的主要代謝途徑有:甾類激素生物合成途徑、核糖體途徑、化學(xué)致癌途徑、視黃醇代謝途徑、原發(fā)性免疫缺陷途徑。4.通過(guò)Meta Core對(duì)網(wǎng)絡(luò)分布進(jìn)行富集分析,我們發(fā)現(xiàn)除了與炎癥系統(tǒng)如IL2、IL6信號(hào)傳導(dǎo)通路、免疫相關(guān)信號(hào)如MHC家族相關(guān)的抗原呈遞途徑、抗原呈遞的吞噬小體信號(hào)關(guān)聯(lián)較大以外,還與膽汁酸代謝調(diào)節(jié)有關(guān)。5.經(jīng)LPS誘導(dǎo)的何首烏醇提液可明顯損傷大鼠肝細(xì)胞并干擾膽汁分泌功能,改變大鼠膽汁成分引起相關(guān)生化指標(biāo)的改變。BSEP與MRP2水平無(wú)顯著影響,而MRP3水平出現(xiàn)代償性升高,提示確實(shí)存在膽汁淤積癥狀,但可能存在其他機(jī)制。
【圖文】：

廣東藥科大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文ABCB11），是膽汁鹽依賴性小管膽汁分泌的主要決定因素[59]和多藥耐藥蛋白-2（MRP2，ABCC2）通過(guò)谷胱甘肽的排泄確定膽汁鹽獨(dú)立膽汁流[57]。 MRP2 還將藥物綴合物和二價(jià)膽汁鹽綴合物輸送到膽汁中。其他 ATP 依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括運(yùn)輸有機(jī)陽(yáng)離子（叔胺或季胺）的多藥耐藥蛋白（MDR1，ABCB1），運(yùn)輸有機(jī)陰離子（包括藥物偶聯(lián)物）的乳腺癌耐藥蛋白（BCRP，ABCG2）和多藥耐藥蛋白 3（MDR3，，ABCB4），磷脂翻轉(zhuǎn)酶。

圖 2.iTRAQ 技術(shù)流程2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 蛋白篩選方法旨在采用不同的篩選方法以篩選出肝損傷機(jī)制可能相關(guān)蛋白。（1）采用第 8 天 LPS+AEP 組蛋白與空白對(duì)照組差異蛋白進(jìn)行篩選第14小時(shí)LPS對(duì)肝損傷影響較大而何首烏無(wú)明顯影響，因此采用第8天LPS+蛋白與空白對(duì)照組差異蛋白（8d-G4/8d-G1）進(jìn)行篩選。（2）排除 LPS 影響因 LPS 本身會(huì)導(dǎo)致急性肝損傷，而第 5 天之后 LPS 組的大鼠體重明顯恢復(fù)， LPS 影響逐漸減弱，但第 8 天 LPS+AEP 組與空白對(duì)照組（8d-G2/8d-G1）不能完除其影響，因此需要排除 LPS 影響。（4）第 8 天 AEP 組與空白對(duì)照組（8d-G3/8d-G1）差異蛋白
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2711870