發(fā)布時間：2020-06-13 20:23

【摘要】：目的:本研究旨在觀察經(jīng)缺氧再灌注處理的H9c2心肌細胞上清中肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH),丙二醛(malondialdehyde,MDA),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量的變化,倒置熒光顯微鏡下細胞內(nèi)活性氧的釋放(reactive oxygen species,ROS),并檢測H9c2心肌細胞增值率、存活率和細胞形態(tài)學(xué)的改變,探究ROS、MDA、SOD等對H9c2心肌細胞再灌注損傷的作用;進一步研究雷公藤甲素(triptolide,TP)對缺氧再灌注損傷的H9c2心肌細胞產(chǎn)生及釋放CK、LDH、ROS、MDA、SOD水平的影響,探討其是否對心肌細胞起到保護作用及其內(nèi)在機制,為減輕心肌細胞缺血再灌注損傷提供新的實驗依據(jù)。方法:1.標本選取:選取培養(yǎng)至指數(shù)增長期的H9c2心肌細胞,根據(jù)需要的檢測指標的不同,分別鋪板96孔板或24孔板;2.模型制備:利用缺氧裝置建立心肌細胞缺氧再灌注損傷模型:給予TP1、5、10、20、50、100nmol/L缺氧處理4 h,繼而復(fù)氧4h;3.檢測指標:缺氧再灌注作用結(jié)束后,用CCK-8法測定細胞增值率及存活率,同時倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)改變;獲取缺氧再灌注處理后的細胞上清,利用相應(yīng)的檢測試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清中的心肌酶及氧化/抗氧化水平:微量酶標法檢測CK、LDH含量,化學(xué)熒光法檢測細胞內(nèi)ROS含量,TBA法檢測MDA含量,羥胺法檢測SOD含量;4.數(shù)據(jù)分析:實驗測得全部數(shù)據(jù),計量資料均用均數(shù)±標準差((?)±s)來描述,經(jīng)方差齊性檢驗、正態(tài)分布檢驗后,采用t檢驗進行統(tǒng)計分析,應(yīng)用GraphPadPrism6.0作圖軟件進行統(tǒng)計作圖,P0.01或0.05,可以認為組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義,全部實驗至少重復(fù)3次。結(jié)果:(1).本實驗經(jīng)過缺氧4小時,再灌注4小時處理H9c2心肌細胞后,成功制備了心肌細胞缺氧再灌注損傷的細胞模型。且缺氧再灌注處理后,可明顯降低H9c2心肌細胞的增殖率(P0.05),提示缺氧再灌注損傷可造成心肌細胞死亡及其形態(tài)學(xué)改變;(2).各濃度TP處理組H9c2細胞生存率明顯高于對照組,細胞形態(tài)學(xué)改變也較輕,其中以TP100、50、20、10nmol/L組的保護作用最為顯著(P0.01);(3).加用TP的各組細胞上清中CK、LDH、MDA水平明顯低于對照組,SOD活性明顯高于對照組,其中以TP50、20nmol/L組的變化最為顯著(P0.01);(4).熒光顯微鏡下觀察:TP可降低H9c2心肌細胞內(nèi)ROS水平,并在本實驗設(shè)置濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性,降低程度以TP50、20nmol/L組最為明顯。結(jié)論:(1).缺氧4小時,再灌注4小時處理可造成H9c2心肌細胞損傷,導(dǎo)致細胞凋亡增加,正常心肌細胞形態(tài)發(fā)生改變。(2).TP對缺氧再灌注誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞損傷具有保護作用,可減少細胞死亡,維持細胞膜完整性,其中機制可能是通過減輕心肌細胞的脂質(zhì)過氧化水平,增強心肌細胞的抗氧化水平實現(xiàn)的,并且該保護作用與TP之間存在濃度依賴。提示TP的應(yīng)用可能成為減輕心肌細胞缺氧再灌注損傷的新策略。
【圖文】：

結(jié)果1 H9c2 心肌細胞缺氧再灌注損傷模型制備1.1 缺氧再灌注處理對細胞增值率的影響分別加入 TP100、50、20、10、5、1nmol/L 進行處理(圖增殖率與缺氧再灌注處理組相比，兩組相應(yīng) TP 濃度組比10nmol/L 組差異不具統(tǒng)計學(xué)意義，而 TP5、1nmol/L 組差異對缺氧再灌注損傷 H9c2 細胞的存活增殖具有保護作用，且選擇未加入 TP 的缺氧再灌注組及正常培養(yǎng)組，倒置顯正常培養(yǎng)的 H9c2 細胞呈現(xiàn)長梭形，大小均勻，形態(tài)規(guī)則，可見。缺氧再灌注損傷組的細胞出現(xiàn)形狀改變，細胞表面皺細胞不再呈現(xiàn)梭形外觀，甚至變圓，細胞膜不完整，邊界不寬。

缺氧再灌注損傷組的細胞出現(xiàn)形狀改變，細胞表面皺縮、體積變小，一細胞不再呈現(xiàn)梭形外觀，甚至變圓，細胞膜不完整，，邊界不清，細胞間隙明顯寬。圖 1 缺氧再灌注損傷對 H9c2 心肌細胞增值率的影響( x±s，n =9) 注：缺氧再灌注組和正常培養(yǎng)組比較：黑色表示缺氧再灌注處理組，灰色表示正常培養(yǎng)組，兩組比較，*P<0.05。
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2711693