【摘要】：艾葉為菊科植物艾(Artemisia argyi Lévl.et Vant.)的干燥葉~([1])。艾葉揮發(fā)油(Artemisia argyi essential oil,AAEO)是艾葉的主要有效成分群之一,具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)咳平喘等作用~([2,3])。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),AAEO還具有抗乙肝病毒和抗肝癌活性。預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),AAEO對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用。本課題將進(jìn)一步研究AAEO體外抗肺癌活性,并初步探討其作用機(jī)制。制備AAEO類脂囊泡并進(jìn)行評(píng)價(jià),研究AAEO及其類脂囊泡體內(nèi)抗肺癌活性和藥代動(dòng)力學(xué)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括以下四方面:1.AAEO體外抗肺癌A549細(xì)胞活性及初步機(jī)制采用MTT法檢測(cè)AAEO對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示:AAEO濃度為660.8μg/mL時(shí),48和72 h細(xì)胞增殖抑制率分別為85.75%和88.37%。AAEO濃度由188.8μg/mL增至660.8μg/mL,72 h細(xì)胞增殖抑制率由37.25%增至88.37%。24、48和72 h IC_(50)值分別為513.54μg/mL、495.60μg/mL和484.27μg/mL。表明AAEO能顯著抑制體外培養(yǎng)的人肺癌A549細(xì)胞增殖,且具有時(shí)間和濃度的依賴性(P0.05)。Annerxin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)經(jīng)不同濃度AAEO處理后的A549細(xì)胞凋亡情況。AAEO濃度為188.8μg/mL和424.8μg/mL時(shí),48 h細(xì)胞凋亡率分別為4.8%和67.1%。說(shuō)明AAEO可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,并具有明顯的濃度依賴性(P0.05)。PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期分布變化。AAEO作用A549細(xì)胞48 h,濃度由0增至330.4μg/mL,G_0/G_1期細(xì)胞比例由67.73%降至52.10%,S期細(xì)胞比例由26.83%增至40.47%,G_2/M期無(wú)明顯變化。由此可知,AAEO可阻滯細(xì)胞周期于S期。推測(cè)與抑制細(xì)胞DNA合成有關(guān)。2.AAEO類脂囊泡的制備與評(píng)價(jià)GC法建立AAEO類脂囊泡多成分含量測(cè)定方法,并進(jìn)行方法學(xué)考察。采用薄膜分散-超聲法制備AAEO類脂囊泡。通過(guò)單因素考察及Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化,得到最優(yōu)處方及制備工藝參數(shù)為:非離子型表面活性劑HLB值為4.88,AAEO加入量為0.141 g,水合溫度為68℃,水合時(shí)間和超聲時(shí)間分別為30 min和10 min。在此條件下,制備的AAEO類脂囊泡包封率大于80%。AAEO類脂囊泡自然光下為乳白色混懸液,掃描電鏡結(jié)果顯示其為具有雙分子層結(jié)構(gòu)的均勻球形。平均粒徑為407.54±11.37 nm,PDI為0.114±0.006,平均電位為-47.0±0.72 mV。AAEO類脂囊泡中桉油精、樟腦和龍腦的平均包封率分別為82.32%、82.64%和88.32%,平均載藥量分別為5.26%、1.11%和1.13%。體外釋藥結(jié)果表明,12 h時(shí),AAEO及其類脂囊泡累積釋放量分別為76.18%和66.07%,AAEO類脂囊泡釋放速率慢。藥物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:AAEO類脂囊泡在強(qiáng)光與高濕條件下較為穩(wěn)定,高溫對(duì)其影響明顯。4℃放置90天,較為穩(wěn)定,25℃放置30天,包封率由89.25%降至71.47%,90天時(shí)降至49.25%。提示AAEO類脂囊泡應(yīng)于4℃存放。3.AAEO及其類脂囊泡體內(nèi)抗肺癌藥效學(xué)通過(guò)對(duì)裸鼠皮下注射A549細(xì)胞建立肺癌模型。隨機(jī)分為8組給藥:陰性對(duì)照組,高、中、低AAEO組,高、中、低AAEO類脂囊泡組,陽(yáng)性對(duì)照組(5-Fu組)。連續(xù)給藥15天,5-Fu組腫瘤生長(zhǎng)抑制率為71.10%,AAEO及其類脂囊泡高劑量組抑瘤率分別為55.54%和58.76%。隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng),5-Fu組裸鼠出現(xiàn)食欲減退、體重下降等毒副反應(yīng),體重由19.33g降至16.35g。AAEO及其類脂囊泡組裸鼠體重?zé)o明顯變化。4.AAEO及其類脂囊泡體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)AAEO及其類脂囊泡大鼠灌胃,分組給藥,兩組所含AAEO的量相同。AAEO組血藥濃度達(dá)峰時(shí)間為1.5 h,濃度為10.0913μg/mL;AAEO類脂囊泡組血藥濃度達(dá)峰時(shí)間為3 h,濃度為10.9533μg/mL。AAEO制成類脂囊泡后,半衰期由3.155 h增至3.993 h,血漿中AAEO的量提高1.29倍。表明AAEO類脂囊泡具有緩釋作用,且可提高AAEO的生物利用度。綜上所述,AAEO及其類脂囊泡具有明顯的抗肺癌活性。推測(cè)與抑制細(xì)胞周期的正常轉(zhuǎn)換,阻滯細(xì)胞于S期,抑制DNA合成有關(guān)。將AAEO包裹在類脂囊泡中,可改善因AAEO難溶于水,揮發(fā)性強(qiáng)使其成藥困難的問(wèn)題,同時(shí)可提高AAEO的生物利用度。為AAEO抗肺癌新藥研究提供了科學(xué)依據(jù)。創(chuàng)新點(diǎn):首次進(jìn)行了AAEO抗肺癌活性研究。為解決AAEO難溶于水、揮發(fā)性強(qiáng)的問(wèn)題,首次研制了AAEO類脂囊泡,并對(duì)其體內(nèi)抗肺癌活性和藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。
【圖文】：

b:48h，c:72h圖 1.1 系列濃度 AAEO 對(duì) A549 細(xì)胞增殖抑制率（n=3）Fig.1.1 The proliferation inhibition rates ofA549 cells treated with AAEO注：與 5-Fu 組比較，**P<0.01。表 1.1 和圖 1.1 可以看出，濃度為 472.0 μg/mL 的 AAEO 作用 A54 72 h，，細(xì)胞增殖抑制率與 5-Fu 組抑制率相當(dāng)。AAEO 濃度為 660.8 和72 h 細(xì)胞增殖抑制率分別為85.75%和 88.37%，均大于 80%。說(shuō)明抑制 A549 細(xì)胞的增殖。24、48 和 72 h IC50值分別為 513.54 μg/mL、L 和 484.27 μg/mL。細(xì)胞增殖抑制率隨 AAEO 濃度的增加和作用時(shí)加，說(shuō)明抑制作用具有時(shí)間和濃度依賴性（P<0.05）。Annerxin V-FITC /PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況系列濃度 AAEO 作用 A549 細(xì)胞 48 h，細(xì)胞凋亡情況如圖 1.2 所示

第一章 AAEO 體外抗肺癌 A549 細(xì)胞活性及初步機(jī)制圖 1.2 中 B1、B2 區(qū)域藍(lán)色熒光分別代表壞死細(xì)胞和晚凋細(xì)胞，B3 區(qū)域熒光代表正常細(xì)胞，B4 區(qū)域紅色熒光代表早凋細(xì)胞。從圖中可以看出，隨EO 濃度變化，各區(qū)域細(xì)胞占比發(fā)生明顯改變。早凋細(xì)胞占比隨 AAEO 濃高而增大。表 1.2 數(shù)據(jù)表明：AAEO 濃度由 0 增至 424.8μg/mL，早期凋亡 1.97%增至 59.57%，說(shuō)明細(xì)胞早期凋亡率與 AAEO 濃度呈正相關(guān)。AAEO為 330.4μg/mL 時(shí)，晚期凋亡率與壞死率出現(xiàn)最大值，分別為 10.9%和 8.1
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R284;R285

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本文編號(hào)：2711373