【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是一種多發(fā)于老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,是癡呆最常見(jiàn)的病因,發(fā)病率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。中國(guó)腦計(jì)劃已經(jīng)將AD列為重要關(guān)注的三大神經(jīng)和精神疾病之一。AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素多樣化,機(jī)制復(fù)雜化,尚不明確,為其治療帶來(lái)巨大困難。目前AD臨床治療藥物僅能減輕癥狀,不能延緩或終止病理進(jìn)程,并且有較多的不良反應(yīng)。因此,AD的新藥研發(fā)迫在眉睫。從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新藥具有巨大的潛力。目前研究顯示有多種芪類化合物具有潛在的抗AD作用。木豆素(cajaninstilbeneacid,CSA)是從木豆[Cajanusc cajan(L.)Millsp.]葉中提取的一種活性芪類化合物,具有神經(jīng)保護(hù)等作用。因此推測(cè)CSA有可能成為治療AD的候選藥物。在新藥研發(fā)過(guò)程中,藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究可以對(duì)候選藥物的動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行早期評(píng)價(jià),提高新藥研發(fā)成功率,降低成本和風(fēng)險(xiǎn),獲得最有效的治療藥物。目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有關(guān)于CSA改善學(xué)習(xí)記憶的研究報(bào)道,其藥物代謝動(dòng)力學(xué)方面僅有兩篇文獻(xiàn)研究。因此,本研究擬采用不同的動(dòng)物模型對(duì)CSA在學(xué)習(xí)記憶方面的藥理作用進(jìn)行評(píng)價(jià),然后從多個(gè)層面揭示其作用機(jī)制,最后在整體動(dòng)物以及細(xì)胞水平探討其體內(nèi)動(dòng)力學(xué)過(guò)程和吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。完成的研究?jī)?nèi)容主要有以下三個(gè)方面:1.木豆素改善學(xué)習(xí)記憶障礙的藥理作用研究首先建立Aβ寡聚體所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的模型,然后采用建立的Aβ寡聚體腦內(nèi)注射模型以及慢性睡眠剝奪模型,通過(guò)空?qǐng)�、物體位置識(shí)別、水迷宮和避暗行為學(xué)檢測(cè)方法評(píng)價(jià)CSA對(duì)模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶障礙的藥理作用。結(jié)果表明,海馬CA1區(qū)雙側(cè)注射Aβ1-42寡聚體(100pmol/只)可以成功建立學(xué)習(xí)記憶障礙模型;在Aβ寡聚體腦內(nèi)注射模型和慢性睡眠剝奪模型中,灌胃給予CSA(7.5、15和30mg/kg)不影響模型小鼠的自主活動(dòng),可以改善模型小鼠對(duì)物體位置的短期辨別記憶能力,提高水迷宮實(shí)驗(yàn)中的學(xué)習(xí)和記憶能力,增強(qiáng)模型小鼠在避暗實(shí)驗(yàn)中獲得和保持被動(dòng)回避能力。2.木豆素改善學(xué)習(xí)記憶障礙的作用機(jī)制研究首先建立測(cè)定小鼠血清和海馬組織中色氨酸(tryptophan,Trp)及其代謝產(chǎn)物(犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、3-羥基犬尿氨酸、5-羥色胺和5-羥吲哚乙酸)、谷氨酸(glutamicacid,Glu)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)含量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法,然后從多個(gè)層面研究CSA改善Aβ寡聚體所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的機(jī)制,主要包括:采用尼氏染色和免疫熒光染色方法監(jiān)測(cè)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)以及海馬內(nèi)Aβ的含量;采用建立的分析方法測(cè)定Trp及其代謝產(chǎn)物、Glu和GABA的含量;采用Western blot方法測(cè)定GluN1和GluN2B受體以及下游PKA/CREB/BDNF/TrkB信號(hào)通路的表達(dá)水平。結(jié)果表明,建立的分析方法具有良好的專屬性、線性、靈敏度和穩(wěn)定性,可用于比較不同實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物體內(nèi)各待測(cè)物含量的差異;CSA改善Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙可能是通過(guò)清除海馬中Aβ,抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,維持Trp代謝的正常水平,逆轉(zhuǎn)Glu和GABA水平失調(diào),抑制GluN2B過(guò)度表達(dá)和上調(diào)PKA/CREB/BDNF/TrkB信號(hào)通路等發(fā)揮作用。3.木豆素的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究首先鑒定大鼠體內(nèi)CSA的主要代謝產(chǎn)物并建立生物樣品分析方法,然后采用建立的分析方法研究CSA及其主要代謝產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性和排泄途徑,最后基于Caco-2細(xì)胞模型研究CSA的腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。結(jié)果表明,血漿、膽汁和尿液中主要存在五種CSA代謝產(chǎn)物(M1-M5),分別為CSA-3-O-glucuronide、CSA-2-COO-glucuronide、6,12-dihydroxy CSA、3-hydroxy-5-methoxystilbene-3-O-glucuronide和6-hydroxy CSA-3-O-glucuronide,說(shuō)明葡萄糖醛酸化和氧化反應(yīng)是其主要代謝途徑;建立的分析方法具有良好的專屬性、線性、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性,可用于CSA的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究;CSA口服吸收迅速,生物利用度為44.36%,首過(guò)效應(yīng)使CSA轉(zhuǎn)化成大量的CSA-3-O-glucuronide限制其吸收,CSA的肝腸循環(huán)、組織分布和腎臟重吸收等藥代動(dòng)力學(xué)特性延緩其體內(nèi)消除過(guò)程,延長(zhǎng)作用時(shí)間;CSA及其代謝產(chǎn)物M1-M5以膽汁排泄為主,總排泄量約占給藥量的78%,CSA以原型形式從膽汁和尿液中排泄的總量約占給藥量的0.6%,而M1-M5的總排泄率為81%,說(shuō)明CSA在體內(nèi)被廣泛代謝,生成大量的代謝產(chǎn)物;CSA在Caco-2細(xì)胞模型中以跨細(xì)胞膜途徑的被動(dòng)擴(kuò)散方式進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn),吸收良好。綜上所述,CSA在不同動(dòng)物模型中均表現(xiàn)出改善學(xué)習(xí)記憶障礙的藥理作用;其作用機(jī)制可能與清除海馬中Aβ,抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化,維持Trp代謝正常水平,逆轉(zhuǎn)Glu和GABA水平失調(diào),抑制GluN2B過(guò)度表達(dá)和上調(diào)PKA/CREB/BDNF/TrkB信號(hào)通路等有關(guān);CSA 口服時(shí)以被動(dòng)擴(kuò)散方式迅速吸收,緩慢消除,存在首過(guò)效應(yīng)、肝腸循環(huán)、組織分布和腎臟重吸收等藥代動(dòng)力學(xué)特性,主要代謝途徑為葡萄糖醛酸化和氧化反應(yīng),以膽汁排泄為主。本研究有助于了解CSA改善學(xué)習(xí)記憶障礙的藥理作用及其藥物代謝動(dòng)力學(xué)規(guī)律,為其在治療AD方面的新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ),并為甚類化合物的開(kāi)發(fā)利用提供參考。
【圖文】：

用棉簽沾少許３０％過(guò)氧化氫，擦拭顱骨表面，使骨縫完全暴露出來(lái)，，找到逡逑前囟并標(biāo)記，調(diào)整頭顱在定位儀上的位置，使得前囟與后囟處在同一水平位置，顱逡逑骨正中線居中，且其兩側(cè)顱骨水平對(duì)稱。參照小鼠腦立體定位圖譜［１８７］（圖２－１），以逡逑前囟為原點(diǎn)，在坐標(biāo)為側(cè)腦室ＡＰ：邋－０．２邋ｍｍ，ＭＬ：邋＋／±１．０ｍｍ；海馬ＡＰ：邋－２．０邋ｍｍ，逡逑ＭＬ：邋±１．５邋ｍｍ處用記號(hào)筆標(biāo)示出，然后高速顱骨鉆孔，清除孔內(nèi)骨屑，針頭戳破硬逡逑腦膜，用棉簽止血。將微量進(jìn)樣器固定于腦立體定位儀的微量注射泵上，以硬腦膜逡逑為標(biāo)準(zhǔn)垂直進(jìn)針２．５０１１１１（側(cè)腦室）／１．５＿（海馬），緩慢注射共２＾１１＾｜３１４２（５0＾１１＾，逡逑２７逡逑

３結(jié)果逡逑３．１邋ＡＰｌ－４２寡聚體的形態(tài)逡逑如圖２－３邋（Ａ）所示，Ａｐｕ４２經(jīng)過(guò)體外配制形成寡聚體，呈球狀，高度為１－６邋ｒｎｎ，逡逑沒(méi)有纖維化聚集體。離心后得到的１００邋ＭＭＡｐＭ２寡聚體溶液４邋°Ｃ下放置８邋ｈ后再十倍逡逑稀釋，用原子力顯微鏡檢測(cè)，仍然只觀測(cè)到球狀寡聚體形態(tài)的ＡＰｍ２，未見(jiàn)纖維化聚逡逑集體。這表明實(shí)際手術(shù)過(guò)程中，同一天內(nèi)所用的ＡＰｕ４２寡聚體溶液形態(tài)差別不大，都逡逑不含有纖維化聚集體。如圖２－３（Ｂ）所示，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示按照本節(jié)“２．２．１”逡逑項(xiàng)下制備的ＡＰｍ２溶液中含有ＡＰ單體、三聚體、四聚體、六聚體和其他較大的寡聚逡逑體。因此，本實(shí)驗(yàn)在體外成功配制出ＡｐＭ２寡聚體溶液，其中不包含纖維化聚集體，逡逑３１逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5


本文編號(hào)：2708269