【摘要】：白念珠菌是一類普遍的寄生真菌,過(guò)度繁殖可以導(dǎo)致人體淺表皮膚、粘膜感染,嚴(yán)重時(shí)可引起肺炎、腦膜炎等深部感染。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道白念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥性不斷增強(qiáng),耐藥白念珠菌嚴(yán)重威脅人體健康。因此,研究新型抗耐藥白念珠菌的藥物具有重大臨床意義。植物中分離出的天然產(chǎn)物來(lái)源廣泛,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,毒性低,活性強(qiáng),對(duì)研發(fā)新型藥物具有重要意義。本課題基于前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),天然化合物芒果苷和魚(yú)腥草素鈉單獨(dú)作用都具有一定抗菌活性,但抑菌濃度太高。因此,本課題重點(diǎn)研究芒果苷和魚(yú)腥草素鈉在較低濃度下協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌的作用,并對(duì)機(jī)制進(jìn)行探索。本研究第一部分探索了芒果苷與氟康唑聯(lián)用抗耐藥白念珠菌的作用和機(jī)制。實(shí)驗(yàn)首先采用科瑪嘉顯色培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)室的24株臨床白念珠菌進(jìn)行鑒定,確保實(shí)驗(yàn)可靠性。應(yīng)用棋盤(pán)式微量稀釋法、生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)、時(shí)間-生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)、時(shí)間-殺菌曲線實(shí)驗(yàn)進(jìn)行多次重復(fù)驗(yàn)證,確定芒果苷與氟康唑合用對(duì)耐藥白念珠菌抑制作用的普遍性和廣泛性。通過(guò)建立小鼠系統(tǒng)性真菌感染模型,研究氟康唑和芒果苷聯(lián)用體內(nèi)抗菌藥效,結(jié)果表明兩藥合用不能明顯提高生存率,但可以延長(zhǎng)模型小鼠的平均生存天數(shù)。本課題進(jìn)一步real-time RT-PCR方法,研究芒果苷與氟康唑協(xié)同抗菌的作用機(jī)制。結(jié)果顯示,,兩藥合用使耐藥基因表達(dá)水平下調(diào),CDR1下調(diào)幅度最大。提示芒果苷協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌分子機(jī)制可能與抑制耐藥蛋白(Cdr1p、Cdr2p、Mdr1p)轉(zhuǎn)運(yùn)功能,迫使白念珠菌對(duì)藥物的敏感性升高有關(guān)。本課題第二部分探究魚(yú)腥草素鈉與氟康唑聯(lián)用抗耐藥白念珠菌的作用和機(jī)制。本研究首先應(yīng)用棋盤(pán)式微量稀釋法證明魚(yú)腥草素鈉與唑類抗菌藥物具有協(xié)同抗菌活性,進(jìn)一步應(yīng)用紙片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)法、棋盤(pán)式微量稀釋法、時(shí)間-生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)、時(shí)間-殺菌曲線實(shí)驗(yàn),研究魚(yú)腥草素鈉與氟康唑合用對(duì)浮游白念珠菌的抑制作用。結(jié)果表明,兩藥合用對(duì)白念珠菌具有明顯抑制作用和殺菌作用。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)菌絲抑制實(shí)驗(yàn)、XTT法測(cè)定被膜形成率實(shí)驗(yàn)、熒光顯微鏡觀察被膜和相對(duì)疏水性實(shí)驗(yàn)研究了魚(yú)腥草素鈉與氟康唑合用對(duì)被模型白念珠菌的抑制作用。結(jié)果顯示,兩藥合用可以明顯抑制菌絲形成、降低被膜形成率、降低細(xì)胞表面疏水性,抑菌藥效和藥物作用濃度呈正比。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)建立小鼠系統(tǒng)性真菌感染模型、大鼠體內(nèi)生物被膜模型,探究?jī)伤幝?lián)合抗體內(nèi)系統(tǒng)性真菌感染和抗生物被膜形成的作用。結(jié)果顯示,魚(yú)腥草素鈉與氟康唑聯(lián)用可以有效降低系統(tǒng)性真菌感染小鼠死亡率,延長(zhǎng)生存天數(shù),并能夠抑制體內(nèi)菌絲和生物被膜形成。課題進(jìn)一步對(duì)魚(yú)腥草素鈉協(xié)同氟康唑抑菌的機(jī)制進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)探索。通過(guò)活性氧實(shí)驗(yàn)、胞內(nèi)ATP水平測(cè)定,表明藥物協(xié)同機(jī)制或與降低細(xì)胞代謝水平,抑制ATP產(chǎn)生有關(guān)。采用免疫熒光法觀察實(shí)驗(yàn)藥物聯(lián)用前后對(duì)細(xì)胞壁成分的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩藥合用后細(xì)胞體積變大,呈“串珠”狀,且細(xì)胞壁中葡聚糖暴露熒光減弱。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示8μg/m L魚(yú)腥草素鈉與4μg/mL氟康唑合用后,84.46%細(xì)胞喪失了選擇通透能力。本研究最后采用real time RT-PCR方法檢測(cè)兩藥合用對(duì)耐藥基因表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示,兩藥合用可選擇性抑制藥物耐藥基因CDR1、CDR2、MDR1、FLU1表達(dá)。因此,魚(yú)腥草素鈉和氟康唑協(xié)同抗耐藥白念珠菌機(jī)制作用可能與降低細(xì)胞代謝水平、降低耐藥基因表達(dá)水平、破壞細(xì)胞壁和使細(xì)胞膜喪失選擇通透能力有關(guān)。本課題第三部分通過(guò)同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量方法(iTRAQ)研究魚(yú)腥草素鈉協(xié)同氟康唑抗白念珠菌機(jī)制,通過(guò)iTRAQ方法共鑒定出2333個(gè)蛋白質(zhì),兩藥合用組共檢測(cè)出150個(gè)可信差異蛋白,排除氟康唑、魚(yú)腥草素鈉單獨(dú)作用差異蛋白,經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)有34個(gè)蛋白質(zhì)已確定生物學(xué)功能。對(duì)差異蛋白分類進(jìn)行生物學(xué)功能分析,發(fā)現(xiàn)兩藥合用使能量代謝蛋白表達(dá)升高(ACO1p、HXK2p、KGD1p、ACS2p),催化β-1,3葡聚糖合成蛋白(FKS1p)表達(dá)降低,促進(jìn)β-1,3葡聚糖分解蛋白(XOG1p、ENG1p)升高,提示兩藥協(xié)同抗白念珠菌作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)β-1,3葡聚糖合成分解、破壞細(xì)胞壁完整性有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2706600