發(fā)布時間：2020-06-09 14:47

【摘要】：肝纖維化(Hepatic fibrosis,HF)是肝臟對各種病因所致慢性肝損傷的修復反應,是慢性肝病共有的病理改變,主要特征是以膠原為主的細胞外基質(zhì)(Extra cellular matrix,ECM)在肝內(nèi)的過度沉積,導致肝臟結(jié)構(gòu)改變和肝功能喪失。雖然近年來肝纖維化病理機制研究已取得很大進展,但是肝纖維化發(fā)病機制尚未闡明,臨床上仍缺乏有效的抗肝纖維化藥物。因此,尋找有效的抗肝纖維化藥物和闡明其確切作用機制具有重要的理論意義和臨床價值。五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)是木蘭科植物五味子中主要的木脂素類成分,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤及保肝等多種藥理學活性。近期研究發(fā)現(xiàn),五味子乙素在體外不僅可以抑制TGF-β誘導的纖維化信號通路,還可以誘導肝星狀細胞的凋亡。然而,其在體內(nèi)的抗肝纖維化作用及其作用機制研究卻未見報道。因此,在本研究中,首先通過構(gòu)建CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型評價五味子乙素抗肝纖維化作用效果。然后,采用基于RNA-seq的轉(zhuǎn)錄組學方法在基因水平上探討五味子乙素抗肝纖維化作用可能的分子機制。隨后,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學的結(jié)果,進一步采用分子生物學技術對肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中的關鍵生物學過程和信號通路進行研究,進一步對五味子乙素抗肝纖維化作用的分子機制進行驗證和補充。最后,通過構(gòu)建肝纖維化疾病靶點數(shù)據(jù)庫,采用在線高通量、快速的“成分-靶點”對接分析,虛擬篩選五味子乙素可能的生物學靶點。在此基礎上,結(jié)合表面等離子體共振和放射性競爭性結(jié)合實驗從親和力的角度對這些作用靶點進行驗證,從而在分子靶點層面闡明五味子乙素抗肝纖維化作用的分子機制。藥理作用評價結(jié)果顯示,五味子乙素顯著的減輕了CCl4誘導的肝纖維化。生化檢測結(jié)果表明,五味子乙素顯著降低了ALT、AST和Hyp含量,病理切片HE、Masson和Sirius Red染色表明五味子乙素明顯減輕了肝細胞壞死和膠原纖維化的沉積。此外,我們還采用免疫組化和Western Blot的方法檢測肝纖維化主要評價指標α-SMA和Collagen-I的表達水平,結(jié)果顯示五味子乙素可以降低其表達水平,這些實驗結(jié)果均說明五味子乙素具有良好的抗肝纖維化作用。在此基礎上,采用高通量測序的方法對其進行全轉(zhuǎn)錄組測序,結(jié)果顯示五味子乙素組與肝纖維化模型組相比上調(diào)的基因數(shù)為2584個,表達下調(diào)的基因數(shù)為1659個。通過GO和Pathway分析,發(fā)現(xiàn)五味子乙素主要影響了氧化還原過程、CCl4的代謝、肝臟的炎癥反應和細胞凋亡等生物學過程。為了驗證這些生物學過程,我們首先通過檢測氧化應激的相關指標,結(jié)果顯示五味子乙素降低了肝纖維化模型大鼠中MDA的含量,提高了SOD和GSH-PX的活性,表明五味子乙素減輕CCl4誘導的氧化應激過程。炎癥反應是肝纖維化重要的病理過程,通過Real time-PCR檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及TGF-β的表達水平,結(jié)果顯示炎癥因子的表達水平也被降低了。此外,TUNEL實驗證明了五味子乙素顯著減輕了CCl4誘導的細胞凋亡。由于肝星狀細胞的活化是肝纖維化發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié),因此在體外,我們重點研究了五味子乙素對肝星狀細胞增殖、活化的影響。實驗結(jié)果顯示,五味子乙素可以抑制TGF-β刺激的肝星狀細胞活化。隨后,對TGF-β引起的信號通路進行研究,我們發(fā)現(xiàn)五味子乙素主要是影響了TGF-β/Smad和MAPK通路。最后,為了闡釋五味子乙素抗肝纖維化作用的生物學靶點,采用化學信息學的方法構(gòu)建肝纖維化疾病靶點數(shù)據(jù)庫,采用高通量對接軟件,虛擬篩選潛在的生物學靶點。在此基礎上,進一步通過放射性競爭性結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)CB2受體有可能為其作用的靶點。綜上,五味子乙素有效的改善了CCl4誘導的大鼠肝纖維化,采用轉(zhuǎn)錄組學的方法在基因水平上研究五味子乙素發(fā)揮抗肝纖維化作用的關鍵基因及其相關的生物學網(wǎng)絡。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學的結(jié)果,對肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中關鍵環(huán)節(jié)進行了研究,進一步闡釋了五味子乙素抗肝纖維化的作用機制。最后,通過化學信息學的方法尋找五味子乙素可能的作用靶點,并通過放射性競爭性結(jié)合實驗進行驗證,發(fā)現(xiàn)其作用的靶點有可能為CB2受體。該研究結(jié)果一方面表明五味子乙素具有保肝、抗纖維化等作用,另一方面從信號通路和生物學靶點的角度闡釋了其抗肝纖維化的分子機制,為后期的新藥開發(fā)和臨床應用提供了實驗支持和理論依據(jù)。此外,本論文采用的研究思路和方法,也為尋找治療其它復雜疾病藥物的靶標提供了方法,具有一定的借鑒意義。
【圖文】：

圖 0- 1 肝纖維化發(fā)病機制（Chem Biol Interact. 2011 Sep 30;193(3):225-31）大量基礎和臨床研究證實，炎癥反應伴隨著各種肝臟疾病，是其必有的過程，也是肝臟組織損傷是否導致纖維化的重要啟動因素，但肝臟組織損傷后是否最終導致肝纖維化的發(fā)生則與炎癥反應與肝組織修復之間的調(diào)節(jié)功能障礙有關[19-22]。肝臟組織損傷后，肝臟修復過程與炎癥反應幾乎同時啟動，此外肝臟還具有再生的能力。肝臟再生和修復過程中，需精密調(diào)控肝臟內(nèi)細胞的存活和死亡、細胞生長和和分化、ECM 的重構(gòu)和降解、細胞因子的產(chǎn)生和氧化應激等過程的平衡[1,23,24]。一旦當參與其中的信號通路、細胞因子和細胞發(fā)生功能異常，就有可能導致肝臟組織修復失調(diào)，那么當肝臟組織發(fā)生過度修復反應時就會導致肝纖維化的產(chǎn)生。因此，導致肝纖維化形成的主要原因是肝臟炎癥反應和修復反應之間的相互作用而導致的肝組織微環(huán)境改變[22]。肝纖維化微環(huán)境的改變主要包括：①促纖維化細胞因子的表達增加，抑制組織纖維化的細胞因子表達減少；②基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑系統(tǒng)失衡；③氧化系統(tǒng)/抗氧化系統(tǒng)失調(diào)，產(chǎn)生氧化應激反應；④趨化因子及其受體表達增加等[23]。因此，肝纖維化微環(huán)境的改變將會進一步加劇肝細胞損傷，朝著

圖 0- 2 肝纖維化的治療策略（Gut. 2015 May;64(5):830-41）綜上所述，雖然我們對肝纖維化的發(fā)病機制及治療也有了一定的進展，但是目抗肝纖維化藥物療效并不理想，且副作用較大。因此，繼續(xù)深入研究并開發(fā)安全效及副作用小的抗肝纖維化藥物仍是目前肝臟疾病研究的重點內(nèi)容。（三）五味子乙素的藥理作用研究進展五味子（Schisandra chinensis）是木蘭科植物五味子的成熟干燥果實，《新修本》中記載 五味皮肉甘酸，核中辛苦，都有咸味 ，，故有五味子之名。五味子在中已有兩千多年的藥用歷史，具有斂肺滋腎、生津止汗、澀精止瀉、寧心安神之功�，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，五味子提取物具有保肝利膽、補腎安神、抗腫瘤及保護心血管藥理作用[42,43]。五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是五味子木脂素類成分中最要的活性成分之一，結(jié)構(gòu)如圖 0-3B，分子式為 C23H28O6，分子量為 400.46。大量研究報道已證實五味子乙素具有廣泛的藥理學活性作用，如抗氧化、抗炎、抗腫和保肝等[44-46]。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

相關期刊論文 前8條

1 王冬堯;陳嘯飛;曹巖;朱臻宇;張俊平;柴逸峰;;生物活性小分子的靶標鑒定[J];中國新藥雜志;2015年10期

2 潘瑤;林劍霞;李妍;;五味子乙素的藥理作用研究概況[J];吉林醫(yī)藥學院學報;2015年01期

3 梁婧;侯海燕;蘭曉霞;孫e

本文編號：2704843