【摘要】：[背景/目的]有關衰老分子機制的學說包括經典的“炎癥反應”、“氧自由基學說”、“DNA甲基化”等,新近還有“自噬學說”、“衰老表型分泌”、“Klotho-FGF23軸”等觀點。最新研究發(fā)現(xiàn),自噬被激活能引起腎小球系膜細胞發(fā)生細胞程序性死亡,誘導腎小管損傷。一些研究發(fā)現(xiàn)中藥單體及提取物能夠通過調控自噬有關信號通路抗衰老,如冬蟲夏草、白藜蘆醇、金絲桃苷等。本文分為兩部分,第一部分,主要闡明近年來衰老的分子機制及中藥的干預作用。生理性衰老是組織、器官、細胞隨時間推移功能逐漸減退的漸進過程,而在一些致病因素影響下可加速衰老進程,促進衰老相關病理產物生成,此稱之為病理性衰老,而腎臟是易受衰老與損傷影響的典型靶器官。第二部分,作者借用D-gal誘導腎臟衰老和損傷模型,在體內與體外實驗中,揭示金絲桃苷可能通過調控自噬抗衰老的作用和機制。[方法]將體外培養(yǎng)的大鼠近端腎小管上皮細胞(NRK-52E)分為正常組、D-gal組、低劑量金絲桃苷組、高劑量金絲桃苷組和VE組,分別進行不同的干預。具體而言,正常組加入1%胎牛血清1 mL;D-gal組加入100 mmol·L-1 D-gal;低劑量金絲桃苷組加入100 mmol·L-1 D-gal+5 mg·L-1金絲桃苷;高劑量金絲桃苷組加入100 mmol-L-1 D-gal+10 mg-L-1金絲桃苷;VE組加入100 mmol·L-1 D-gal+50 mg·L-1VE。在干預后的24h,①觀察D-gal對NRK-52E 細胞 Klotho,P53,P21,IL-1,TGF-β,MCP-1 蛋白表達水平、β-半乳糖苷酶染色、慢病毒感染以及AMPK-mTOR-ULK1信號活性的影響;②觀察D-gal、金絲桃苷以及VE對NRK-52E細胞增殖活性的影響;③觀察金絲桃苷、VE、CC對D-gal誘導的NRK-52E 細胞Klotho,P53,P21,IL-1,TGF-β,MCP-1蛋白表達水平、SA-β-gal 染色,以及LC3、Beclin1和AMPK-mTOR-ULK1信號活性的影響。在體內實驗中,將SD大鼠分為5組,具體分組情況如下:正常組,D-gal 4周組,D-gal 8周組,D-gal+金絲桃苷組,D-gal+VE組,正常組給予蒸餾水喂養(yǎng)8周,D-gal 4周組給予D-gal 300mg/kg/d皮下注射4周;D-gal 8周組給予D-gal 300mg/kg/d皮下注射8周;D-gal+金絲桃苷組給予D-gal 300mg/kg/d皮下注射+金絲桃苷20mg/kg/d灌胃8周,VE組給予D-gal 300mg/kg/d皮下注射+VE 30mg/kg/d灌胃8周;在4周結束時,D-gal 4周組SD大鼠麻醉處死,8周結束時,所有剩余大鼠麻醉,通過腹腔注射氯胺酮和地西泮(1:1)麻醉所有大鼠,并通過心臟穿刺處死,收集血清和腎臟皮質部分,觀察以上指標基礎上,觀察LC3、Klotho免疫組化表達以及Scr、BUN水平。[結果]D-gal誘導腎臟與腎小管上皮細胞發(fā)生衰老和損傷,Klotho蛋白表達下降,P53、P21蛋白表達上升,IL-1、MCP-1、TGF-β蛋白高表達,自噬標志性蛋白LC3、Beclinl表達升高,調控自噬相關信號蛋白,mTOR水平無變化,而AMPK-ULK1信號通路活性顯著升高;加入金絲桃苷、VE后,以上指標均發(fā)生顯著變化,發(fā)現(xiàn)金絲桃苷作用同VE類似,通過抑制AMPK-ULK1信號活性介導自噬改善D-gal誘導的腎臟衰老和損傷。[結論]金絲桃苷通過調節(jié)AMPK-ULK1信號通路,抑制自噬活性,同時在體內和體外中保護腎臟免于衰老和損傷。
【圖文】：

究金絲桃苷、ＶＥ是否可以在體外減輕Ｄ－ｇａｌ誘導的腎小管細胞衰老和損傷。結果發(fā)現(xiàn)，逡逑將金絲桃苷、ＶＥ分別與Ｄ－ｇａｌ（邋１００邋ｍｍｏｌ．Ｌ邋４）聯(lián)合干預細胞，在聯(lián)合干預２４ｈ后，ＳＡ－ｐ－ｇａｌ逡逑強陽性染色結果顯著改善（圖３Ａ），和模型組相比，，差異具有統(tǒng)計學意義（，＜０．０５或逡逑＜０．０１）；同時觀察Ｋｌｏｔｈｏ、ｐ２１、ｐ５３、ＩＬ－１和ＴＧＦ－ｐ蛋白發(fā)現(xiàn)，其蛋白表達水平均明顯逡逑好轉（圖３Ｂ，３Ｃ，４Ａ，４Ｂ），同模型組組相比，差異具有統(tǒng)計學（＊／？＜０．０５或＊＊ｐ＜０．０１）。逡逑不同劑量的金絲桃苷（５，１０，１５ｍｇ‘Ｌ－１）、ＶＥ（１５，邋２５，ＳＯｍｇ．Ｌ＊１）與邋Ｄ－ｇａｌｌ００ｍｍｏｌ－Ｌ逡逑－１聯(lián)合干預細胞２４邋ｈ后，細胞墻殖活性沒有明顯變化（圖３Ｄ，Ｅ）。此外，Ｄ－ｇａｌ和化合逡逑物Ｃ邋（ＣＣ，ＡＭＰＫ的抑制劑）聯(lián)合干預細胞２４ｈ，與金絲桃苷、ＶＥ相似，ＮＲＫ－５２Ｅ細逡逑胞中的ｐ５３、ｐ２１、ＩＬ－１和ＴＧＦ－Ｐ蛋白表達水平明顯下降（圖４Ｃ，邋Ｄ），與模型組相比，逡逑差異具有統(tǒng)計學意義（Ｖ＜0．0５或＊＊ｐ＜０．０１）。逡逑２６逡逑
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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1 劉不悔;金絲桃苷調控AMPK-ULK1介導自噬改善D-半乳糖誘導腎臟衰老與損傷的作用和機制[D];南京中醫(yī)藥大學;2019年

本文編號：2696455