【摘要】：目的:納米氧化鋅(Zinc oxide nanoparticles,ZnO NPs)在工業(yè)中廣泛應(yīng)用,其除對肝臟和神經(jīng)有毒性之外,還對雄性生殖系統(tǒng)有毒性,但其確切機制仍不甚清楚。本課題主要通過觀察ZnO NPs對活體雄性小鼠睪丸組織和小鼠睪丸間質(zhì)細胞的影響,探究自噬在ZnO NPs誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡中的作用及調(diào)節(jié)機制。方法:用HE染色檢測ZnO NPs對小鼠睪丸及附睪的病理損傷,用Western blot檢測ZnO NPs對小鼠睪丸組織的凋亡和自噬的影響,活性氧檢測試劑盒檢測ZnO NPs對小鼠睪丸組織和小鼠睪丸間質(zhì)TM3細胞氧化應(yīng)激的影響。用ELISA法檢測ZnO NPs對小鼠血清睪酮含量的影響。用MTT法檢測ZnO NPs和H2O2對小鼠睪丸間質(zhì)TM3細胞活性的影響;分別用Western blot和Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測ZnO NPs對TM3細胞凋亡的影響;分別用Western blot和電鏡檢測ZnO NPs和H2O2對TM3細胞自噬的影響。結(jié)果:用不同濃度的ZnO NPs(0,100,200,400 mg/kg/d)連續(xù)給小鼠灌胃28天后,與對照組相比,ZnO NPs對小鼠睪丸及附睪系數(shù)無明顯影響(P0.05)。HE染色結(jié)果顯示,對照組小鼠睪丸生精細胞排列整齊、緊致;與對照組相比,100 mg/kg ZnO NPs處理組的小鼠睪丸生精細胞排列也比較整齊,并無明顯的生精細胞脫落;200及400 mg/kg ZnO NPs處理組的小鼠睪丸生精細胞排列明顯紊亂、松散,并出現(xiàn)不同程度的脫落。ZnO NPs還顯著降低小鼠附睪中的精子數(shù)量。Western blot結(jié)果顯示,ZnO NPs可增加小鼠睪丸組織內(nèi)cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3、Bax蛋白含量并抑制Bcl-2蛋白的表達,提示ZnO NPs可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織凋亡。ZnO NPs還可使小鼠睪丸組織內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白LC3-II含量、LC3-II/LC3-I的比例以及自噬相關(guān)蛋白Atg-5和Beclin-1的表達顯著增加,提示ZnO NPs可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織自噬。與對照組相比,ZnO NPs處理組小鼠睪丸組織中的MDA和GSH含量分別增加和降低;ZnO NPs還呈濃度依賴式地抑制小鼠睪丸組織內(nèi)SOD和GSH-PX的活性,提示ZnO NPs可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激。ELISA結(jié)果顯示,ZnO NPs可顯著降低小鼠血清中睪酮含量(P0.05),提示ZnO NPs可能影響睪丸間質(zhì)細胞的功能。體外實驗表明,ZnO NPs呈濃度依賴式地抑制小鼠睪丸間質(zhì)TM3細胞活性(P0.05),并顯著增加TM3細胞內(nèi)cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3和Bax蛋白含量和抑制細胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達,提示ZnO NPs可誘導(dǎo)TM3細胞凋亡。Annexin V-FITC和PI雙染色法進一步證實ZnO NPs可誘導(dǎo)TM3細胞凋亡。ZnO NPs可誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激(P0.05);H2O2在顯著抑制TM3細胞活性的同時(P0.05),還可誘導(dǎo)TM3細胞凋亡,而在用N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)抑制細胞氧化應(yīng)激后,ZnO NPs對細胞活性的抑制和凋亡的誘導(dǎo)作用均明顯減弱。以上結(jié)果顯示,氧化應(yīng)激參與了ZnO NPs對TM3細胞凋亡的誘導(dǎo)。Western blot結(jié)果顯示,ZnO NPs和H2O2可誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)TM3細胞自噬,用NAC抑制細胞內(nèi)氧化應(yīng)激后,ZnO NPs對TM3細胞自噬的誘導(dǎo)明顯降低,提示氧化應(yīng)激還參與了ZnO NPs對小鼠睪丸間質(zhì)TM3細胞自噬的誘導(dǎo)。在用自噬抑制劑3甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)抑制細胞自噬后,ZnO NPs對TM3細胞活性的抑制和細胞凋亡的誘導(dǎo)更明顯。結(jié)論:氧化應(yīng)激參與了ZnO NPs對小鼠睪丸組織和小鼠睪丸間質(zhì)TM3細胞的凋亡和自噬;自噬抑制可顯著增加ZnO NPs對TM3細胞的凋亡。
【圖文】：

ZnONPs的特征

圖 2. ZnO NPs 對小鼠睪丸及附睪系數(shù)的影響Fig.2. Effect of ZnO NPs on testis and epididymal coefficient in male mice. Testis andepididymis were obtained from the male mice treated with 0-400 mg ZnO NPs/kg/day for 28 days.The experiment was done in triplicate and repeated three times. Data were analyzed by one-wayANOVA.3.3. ZnO NPs 對小鼠睪丸毒性的影響給小鼠分別用 0, 100, 200, 400 mg/kg 的 ZnO NPs 連續(xù)染毒 28 d 后，用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察 ZnO NPs 對小鼠睪丸及附睪組織形態(tài)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠睪丸生精細胞排列整齊、緊致；與對照組相比，100 mg/kg ZnO NPs處理組的小鼠睪丸生精細胞排列也比較整齊，并無明顯的生精細胞脫落；200 及400 mg/kg ZnO NPs 處理組的小鼠睪丸生精細胞排列明顯紊亂、松散，并出現(xiàn)不同程度的脫落（圖 3）。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2695892