【摘要】：目的:1.完善hiPSC誘導(dǎo)為肝樣細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)2.建立hiPSC誘導(dǎo)而來的肝樣細(xì)胞的氧化損傷模型3.探討中藥單體龍膽苦苷及黃芩素對(duì)于hiPSC誘導(dǎo)而來的肝樣細(xì)胞的氧化損傷模型的肝保護(hù)作用方法:1.hiPSC誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞:在分化前,將ips細(xì)胞培養(yǎng)于基質(zhì)膠包被后的涂層培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)液為hiPSC培養(yǎng)液。開始誘導(dǎo)分化:使用細(xì)胞因子4步驟誘導(dǎo)分化方法:第1階段8天,hiPSC分化為內(nèi)胚層細(xì)胞的誘導(dǎo),即在人iPSCs中加入100 ng/mL激活素 A(Activin A)、10 ng/mL 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(bone morphogenetic proteins-4.BMP-4)、20 ng/mL 成纖維生長因子-2(Fibroblast growth factor-2.FGF-2)、2%B27和1640細(xì)胞培養(yǎng)液;第2階段5天,為內(nèi)胚層細(xì)胞向類肝細(xì)胞的分化,即加入20 ng/mL BMP-4、10 ng/mL FGF-2、2%B27和1640細(xì)胞培養(yǎng)液;第3階段5天,類肝細(xì)胞的擴(kuò)增,即加入20 ng/mL肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor.HGF)、2%B27和1640細(xì)胞培養(yǎng)液;第4階段5天,類肝細(xì)胞的成熟,加入HCM和20ng/mL制瘤素M(Oncostatin M)。期間,用倒置熒光顯微鏡觀察人iPSCs的誘導(dǎo)過程中第0、3,12,23天的細(xì)胞形態(tài)變化,觀察人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞是否具有肝細(xì)胞的形態(tài);用激光共聚焦技術(shù)檢測iPSCs及肝細(xì)胞標(biāo)志蛋白:GATA4、HNF-4α、AFP、ALB、P450的蛋白表達(dá),以鑒定整個(gè)誘導(dǎo)過程。2.肝樣細(xì)胞氧化模型造模方法:使用L0-2細(xì)胞作為預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定H2O2氧化損傷造模時(shí)的用量,將處于對(duì)數(shù)期生長的L0-2細(xì)胞消化后以7000個(gè)每孔接種于96孔板中,待24小時(shí)貼壁后分別加入用RPMI1640-FBS培養(yǎng)基稀釋成10組不同濃度的H2O2工作液(100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 μmol/L),以及0μmol/L的對(duì)照組,共計(jì)11組,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。在造模24 h后,MTT檢測其生存率以計(jì)算H2O2的IC50用量。將該用量加入誘導(dǎo)成功的肝樣細(xì)胞中,檢測對(duì)其細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)及丙二醛(MDA)的含量和細(xì)胞上清中谷丙氨酸轉(zhuǎn)移酶ALT、及谷草氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)水平的影響。3.中藥單體龍膽苦苷對(duì)于H2O2誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞氧化損傷模型的肝保護(hù)作用研究預(yù)實(shí)驗(yàn)使用LO-2以確定龍膽苦苷的有效作用范圍。取已成功誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞,加入300 μ mol/L的H2O2制作氧化模型。在造模24 h后,棄上清,加入4個(gè)濃度的龍膽苦苷溶液,其中設(shè)置對(duì)照組不造模不加龍膽苦苷,設(shè)置造模組不加龍膽苦苷,以檢測氧化損傷造模24h龍膽苦苷的治療作用。從肝保護(hù)相關(guān)生物標(biāo)志物血清丙氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、及丙二醛(MDA)等變化考察龍膽苦苷對(duì)肝的保護(hù)作用機(jī)制。4.中藥單體黃芩素對(duì)于H2O2誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞氧化損傷模型的肝保護(hù)作用研究預(yù)實(shí)驗(yàn)使用LO-2以確定黃芩素的有效作用范圍。取已成功誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞,棄上清,加入不同劑量濃度的黃芩素溶液,加入黃芩素2h后,棄上清,加入300 μ mol/L H2O2制作氧化模型,其中設(shè)置對(duì)照組不造模不加黃芩素,設(shè)置造模組不加黃芩素。并于24 h后收集細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,以檢測黃芩素的預(yù)防作用。取已成功誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞,加入300 μ mol/L的H2O2制作氧化模型。在造模24h后,棄上清,加入4個(gè)濃度的龍膽苦苷溶液,其中設(shè)置對(duì)照組不造模不加龍膽苦苷,設(shè)置造模組不加龍膽苦苷,以檢測黃芩素對(duì)于氧化損傷的肝樣細(xì)胞模型的預(yù)防作用。并檢測SOD、MDA、ALT、AST結(jié)果:1、人iPSCs誘導(dǎo)肝樣細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞形態(tài)變化:可見在開始誘導(dǎo)的第一天,細(xì)胞仍然保持iPS的形態(tài),既成集落生長,細(xì)胞小且圓,密集生長,集團(tuán)邊緣明顯。在第一階段誘導(dǎo)結(jié)束的第八天,可見細(xì)胞集團(tuán)邊緣散開,細(xì)胞變大且不在呈圓形,而是類似橢圓形。在第二階段誘導(dǎo)結(jié)束的第十三天,5倍鏡下已完全無法看到細(xì)胞集落邊緣,細(xì)胞完全散開,20倍鏡下可見細(xì)胞間隙變大,細(xì)胞大小不一,細(xì)胞核小。在第三階段誘導(dǎo)結(jié)束的第十八天,5倍鏡下可見細(xì)胞變大,20倍鏡下可見細(xì)胞形狀同一,間隙變大且大小相似。在第四階段誘導(dǎo)結(jié)束的第二十三天,5倍鏡下可見細(xì)胞排列整齊,20倍鏡下可見細(xì)胞大小形狀基本一致且與正常人肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征相似,既呈多角形,核大且圓。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果:在誘導(dǎo)過程的第8天,內(nèi)胚層標(biāo)記蛋白GATA表達(dá)。在誘導(dǎo)過程的第13天,標(biāo)記蛋白HNF-4 α表達(dá),標(biāo)志著細(xì)胞在向肝細(xì)胞分化譜系在體外的分化。在誘導(dǎo)過程的第18天,標(biāo)記蛋白AFP表達(dá),這是肝祖細(xì)胞的另一個(gè)重要指標(biāo),通常原始的肝細(xì)胞中表達(dá)。在誘導(dǎo)過程的第23天,標(biāo)記蛋ALB、P450表達(dá),這表明細(xì)胞具有分泌和解毒的功能。從結(jié)果看細(xì)胞的分化各個(gè)階段的誘導(dǎo)過程準(zhǔn)確無誤,誘導(dǎo)的肝細(xì)胞已經(jīng)成熟。在不同階段的不同視野內(nèi)統(tǒng)計(jì)標(biāo)記蛋白及核蛋白的表達(dá)量可計(jì)算誘導(dǎo)成功率超過85%。2.使用H202誘導(dǎo)LO-2細(xì)胞氧化損傷的劑量可以使用在肝樣細(xì)胞氧化損傷造模中,并可以時(shí)肝樣細(xì)胞表現(xiàn)出氧化損傷時(shí)表現(xiàn)出的多種酶系含量變化。3.龍膽苦苷作用于H2O2誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞氧化損傷模型的治療時(shí),可對(duì)于細(xì)胞內(nèi)ALT,AST有不同程度的降低,其中ALT呈濃度依賴式降低,而AST對(duì)濃度的依賴并不明顯。SOD有不同程度的升高,MDA有不同程度降低,對(duì)濃度的依賴同樣不明顯,說明龍膽苦苷對(duì)于iPSC誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞氧化損傷模型有治療作用。4.黃芩素作用于預(yù)防H2O2誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞氧化損傷模型時(shí),對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的ALT,AST有不同程度的降低,且呈濃度依賴性,說明黃芩素對(duì)肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性保護(hù)的效果較好;SOD有不同程度的升高且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性,MDA有不同程度降低,說明黃芩素可提高肝細(xì)胞對(duì)氧化自由基的清除率。說明黃芩素對(duì)于iPSC誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞氧化損傷模型有預(yù)防作用。結(jié)論:1.hiPSCs使用因子四步誘導(dǎo)分化方法可以將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成肝樣細(xì)胞,成功分化的細(xì)胞具有肝細(xì)胞的形態(tài)可表達(dá)重要的肝細(xì)胞蛋白。2.H2O2可作為肝樣細(xì)胞的氧化損傷模型誘導(dǎo)劑。3.龍膽苦苷及黃芩素對(duì)于H2O2誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞氧化損傷模型有治療及預(yù)防作用,其機(jī)制為清除氧化自由基,阻止細(xì)胞膜的破壞。
【圖文】：

ＳＧ誘導(dǎo)為肝樣細(xì)胞過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化第１ｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｈｅｐａ－ｃｅｌｌｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ｈｉＰＳＣW逡逑ｍｔｍ逡逑Ｇ誘導(dǎo)為肝樣細(xì)胞過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化第１ａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｈｅｐａ－ｃｅｌｌｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ｈｉＰＳＣ

ＳＧ誘導(dǎo)為肝樣細(xì)胞過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化第１ｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｈｅｐａ－ｃｅｌｌｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ｈｉＰＳＣＩ逡逑ＰＳＣ誘導(dǎo)為肝樣細(xì)胞過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化第８ｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｈｅｐａ－ｃｅｌｌｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ｈｉＰＳ
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 曹惠敏;諶貝貝;鄧鈺雙;盧茜;余剛;;黃芩苷增強(qiáng)N2a/APPswe細(xì)胞的抗氧化能力并促進(jìn)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)的核轉(zhuǎn)位[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2015年12期

2 田夢曦;劉文蘭;;肝損傷中藥治療研究進(jìn)展[J];遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2015年04期

3 汪紀(jì)倉;朱華麗;肖橋;張才;王宏偉;楊自軍;;黃芩素對(duì)鎘致大鼠肝臟損傷的保護(hù)作用研究[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2014年23期

4 薩可佳;;龍膽苦苷有效部位對(duì)小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J];海峽藥學(xué);2014年10期

5 龐純;蔣萍;季莉莉;;黃芩素激活核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2拮抗肝毒性的研究[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2014年04期

6 喬慧蓮;陳浩;陳文豪;張磊;易定華;;龍膽苦甙后處理對(duì)心臟缺血再灌注損傷的防治作用[J];山東醫(yī)藥;2013年35期

7 韓泳;王玉;崔燕芒;趙燕;;黃芩素對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2013年06期

8 徐關(guān)麗;陳露露;蔡江輝;袁紅梅;劉穎菊;;龍膽苦苷對(duì)膿毒癥小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J];激光雜志;2013年01期

9 王欣;熊哲;;黃芩素對(duì)急性肝損傷模型小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制[J];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2012年08期

10 蔣萍;楊陽;季莉莉;王崢濤;;黃芩素對(duì)4種肝損傷物質(zhì)造成肝細(xì)胞毒性的拮抗作用[J];中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2012年06期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王愛艷;東北龍膽通過JNK/ERK MAPK通道抑制對(duì)乙酰胺基酚引起的急性肝損傷[D];延邊大學(xué);2010年

，

本文編號(hào)：2695555