【摘要】：目的:1、觀察補腎健脾活血方對成骨細(xì)胞ALP、OPG、OPN、BMP-2表達(dá)的影響;2、探討補腎健脾活血方通過DKK1、Sost蛋白促進成骨細(xì)胞分化的作用機制;方法:1、中藥干預(yù)原代成骨細(xì)胞,采用胰酶消化法提取原代成骨細(xì)胞(1)分別用空白血清、補腎健脾活血方高、中、低劑量血清,干預(yù)原代成骨細(xì)胞,采用CCK-8檢測成骨細(xì)胞活性;(2)分別用空白血清、補腎健脾活血方中、低劑量血清、阿侖膦酸鈉維D_3片(陽性藥)血清干預(yù)原代成骨細(xì)胞,采用BCIP-NBT檢測成骨細(xì)胞ALP表達(dá);(3)分別用空白血清、補腎健脾活血方中劑量血清、陽性藥血清干預(yù)原代成骨細(xì)胞,RT-qPCR檢測OPG、OPN、BMP-2 mRNA表達(dá),WB檢測OPG、BMP-2蛋白表達(dá);2、沉默DKK1、Sost腺病毒轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞,中藥干預(yù)病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞空載腺病毒、沉默DKK1腺病毒(sh-DKK1)、沉默Sost腺病毒(sh-Sost)、沉默DKK1腺病毒和沉默Sost腺病毒(sh-DKK1+sh-Sost)分別轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞:空白血清、含藥血清分別干預(yù)腺病毒轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞,ALP檢測試劑盒檢測ALP的活性、Calcium OtangeTM Indicators探針檢測鈣離子的濃度、WB檢測BMP-2,CTGF、FGF2、Runx2,TNF-α蛋白表達(dá);結(jié)果:1、補腎健脾活血方干預(yù)原代成骨細(xì)胞(1)在12h、24h、48h高、中、低劑量細(xì)胞活性呈上升趨勢,72h后細(xì)胞活性呈下降趨勢,與空白血清比較,中劑量血清在48h細(xì)胞活性最強。(2)含藥血清ALP染色陽性率均比空白血清組高,中劑量含藥血清ALP的染色率高于低劑量染色率和陽性藥染色率。(3)與空白血清組比較,中劑量血清組可以提高OPG、OPN、BMP-2的mRNA的表達(dá);與空白血清比較,陽性藥物組可以降低BMP-2 mRNA的表達(dá)。(4)與空白血清組比較,中劑量血清組可以提高OPG、BMP-2蛋白的表達(dá);與空白血清比較,陽性藥組的OPG的表達(dá)降低。2、沉默DKK1、Sost腺病毒轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞,中藥干預(yù)病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(1)分別在NC對照組、sh-DKK1組、sh-Sost組、sh-DKK1+sh-Sost組中,與空白血清干預(yù)比較,含藥血清可以提高ALP活性。(2)分別在NC對照組、sh-DKK1組、sh-Sost組、sh-DKK1+sh-Sost組中,與空白血清干預(yù)比較,含藥血清可以降低鈣離子濃度。(3)NC對照組、sh-DKK1組、sh-DKK1+sh-Sost組分別與空白血清比較,含藥血清可以提高各組中BMP-2、CTGF、FGF2、Runx2蛋白表達(dá),降低TNF-α蛋白的表達(dá);與空白血清比較,含藥血清可以提高sh-Sost組中CTGF、FGF2、Runx2蛋白的表達(dá),降低TNF-α蛋白的表達(dá)。結(jié)論:1、補腎健脾活血方干預(yù)原代成骨細(xì)胞,可以增加ALP的表達(dá),增加OPG、OPN、BMP-2 mRNA,OPG、BMP-2蛋白的表達(dá),促進成骨細(xì)胞分化。2、在沉默MG-63細(xì)胞中DKK1、Sost,同時補腎健脾活血方干預(yù)后;補腎健脾活血方可以提高ALP活性,降低鈣離子濃度,提高BMP-2,CTGF,FGF2,Runx2蛋白表達(dá),降低TNF-α蛋白表達(dá)。
【圖文】：

圖1 BMP-Smads 信號通路[39]路 蛋白、配體等相關(guān)的蛋白構(gòu)成 Notch 通路。白，Notch 受體和相鄰細(xì)胞表面的配體相互作CE 及 -分泌酶分別作用于 Notch 受體，連活性片段被釋放出來，活性片段轉(zhuǎn)移到細(xì)胞白）、共活化因子 MAML，這兩種蛋白結(jié)合，基因的表達(dá)[40]。在 OB 中，Notch 可以提高 Hey化作用。Engin 等[41]在轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中的表達(dá)，能夠增加骨量，也會形成硬化骨，，但關(guān)的遲發(fā)型骨質(zhì)疏松。Watanabe[42]在實驗中發(fā)后，細(xì)胞周期蛋白 D 和 E 的活性升高，Notch 殖能力。號通路路由 Hedgehog 信號蛋白、Ptched（Ptc）、Sm和下游靶基因組成。Ptc 是細(xì)胞膜受體，當(dāng) H

圖 2 Wnt/β-catenin 信號通路的組成與調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換過程始終伴隨機體發(fā)生，眾多通路參與骨轉(zhuǎn)換的過程，Wnt/ -catenin 通路可以調(diào)控成骨細(xì)胞的分化和調(diào)節(jié)骨基質(zhì)的形成[94]。Wnts 能夠抑制 MSC 向軟骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞等方向分化，而促進 MSC 向 OB 的分化，同時增強 OB 的增殖、抑制 OB 的凋亡、并促進 OB 礦化[95, 96]。Glass 等[97]實驗證實 TCF 和 -catenin 可共同調(diào)節(jié) OB 中 OPG
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2693286