【摘要】：目的:本文利用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠IBD模型,給予黃連素處理,分離小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞檢測其在調(diào)節(jié)Th2和Th17功能中可發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子IL-6、IL-18、IL-23、IL-25和IL-33,同時(shí)檢測小鼠腸固有層淋巴細(xì)胞幾種代表性的細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-17A和IFN-γ,以了解黃連素誘導(dǎo)腸黏膜上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對免疫細(xì)胞可能的調(diào)節(jié)作用,以進(jìn)一步探究黃連素通過影響腸黏膜上皮細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的種類和水平,間接調(diào)節(jié)腸道免疫細(xì)胞免疫功能,減輕腸道炎癥的新機(jī)制。研究方法:1、模型建立及實(shí)驗(yàn)分組:利用C57BL/6小鼠,建立DSS誘導(dǎo)的急性腸炎動(dòng)物模型:五天內(nèi)實(shí)驗(yàn)組(黃連素+DSS組)與對照組(DSS組)小鼠均自由飲用3%DSS(用PBS配置)溶液,空白對照組(PBS組)小鼠自由飲用PBS溶液。實(shí)驗(yàn)組小鼠每天早八點(diǎn)灌胃黃連素溶液,對照組與空白對照組灌胃等量的PBS溶液,三組小鼠于第六天處死。2、按照Cooper HS的方法,每天定時(shí)測量小鼠體重,觀察糞便性狀、及大便隱血狀況。3、組織學(xué)結(jié)果鑒定:急性腸炎模型誘導(dǎo)第六天,三組小鼠處死后各取近心端1/2處結(jié)腸組織0.5cm,浸泡于4%多聚甲醛溶液固定,經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察模型組織形態(tài)結(jié)構(gòu)以及炎癥情況,并按照炎癥分級標(biāo)準(zhǔn)評估病理組織學(xué)得分。4、腸黏膜上皮細(xì)胞的鑒定與細(xì)胞因子的檢測:急性腸炎模型誘導(dǎo)第六天,處死小鼠,三組取腸管后均分離并提取腸黏膜上皮細(xì)胞(IEC);用流式細(xì)胞儀鑒定IEC并細(xì)胞計(jì)數(shù)后;用Real-time PCR法、Western blotting法檢測腸黏膜上皮細(xì)胞細(xì)胞因子IL-6、IL-18、IL-23、IL-25、IL-33的表達(dá)水平。5、腸固有層淋巴細(xì)胞的鑒定與細(xì)胞因子的檢測:急性腸炎模型誘導(dǎo)第六天,處死小鼠,三組取腸管后均分離并提取腸固有層淋巴細(xì)胞(LPL);用流式細(xì)胞儀鑒定LPL并細(xì)胞計(jì)數(shù)后,在體外刺激48h,用ELISA法檢測其IL-4、IL-10、IL-17A、IFN-γ的表達(dá)水平。研究結(jié)果:1、DSS誘導(dǎo)的小鼠急性腸炎模型建立成功。與PBS組小鼠相比,疾病模型小鼠均出現(xiàn)IBD癥狀,存在活動(dòng)減少、體型消瘦、精神萎靡、排泄稀便、血便的現(xiàn)象,疾病活動(dòng)指數(shù)上升,腸管明顯縮短、狹窄變形、腸腔內(nèi)存在稀便。但黃連素+DSS組小鼠較DSS組小鼠相比,疾病癥狀較輕,腸管病變情況較輕,結(jié)果說明經(jīng)口投黃連素使小鼠急性腸炎癥狀減輕。2、HE染色結(jié)果顯示,疾病模型小鼠與PBS組小鼠相比均存在杯狀細(xì)胞消失、大量炎性細(xì)胞浸潤的情況。DSS組比黃連素+DSS組情況更加嚴(yán)重,杯狀細(xì)胞大面積消失、隱窩大面積消失,炎性細(xì)胞浸潤至黏膜肌層,黏膜增厚并伴有水腫(P0.01)。結(jié)果說明經(jīng)口投黃連素使小鼠腸道炎癥程度減輕。3、流式細(xì)胞術(shù)表面染色實(shí)驗(yàn)中,檢測到經(jīng)純化的腸黏膜上皮細(xì)胞層細(xì)胞CD3~-B220~-細(xì)胞可達(dá)95%以上,CD45.2呈單峰,而未經(jīng)純化的腸黏膜上皮層細(xì)胞CD3~-B220~-僅占43.5%,CD45.2呈雙峰。結(jié)果說明純化腸黏膜上皮細(xì)胞方法有效。4、流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色實(shí)驗(yàn)中,分離的腸黏膜上皮細(xì)胞經(jīng)流式胞內(nèi)染色FITC-CK18,發(fā)現(xiàn)峰值明顯右移,陽性率達(dá)85%以上。結(jié)果可證明所提細(xì)胞為腸黏膜上皮細(xì)胞。5、Real-time PCR法檢測結(jié)果顯示,與DSS組小鼠相比,黃連素+DSS組小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)IL-6、IL-23 mRNA表達(dá)水平明顯下降(P0.01),IL-25、IL-33 mRNA表達(dá)水平明顯下降(P0.05),IL-18mRNA表達(dá)水平明顯上升(P0.05)。以上結(jié)果說明,在DSS誘導(dǎo)的急性腸炎中,黃連素可以下調(diào)腸黏膜上皮細(xì)胞因子IL-6、IL-23、IL-25和IL-33 mRNA的表達(dá)水平,提升IL-18mRNA的表達(dá)水平。6、應(yīng)用Western blotting法檢測結(jié)果顯示,與DSS組相比,黃連素+DSS組小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)IL-6、IL-23和IL-25蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.05),IL-33蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.01),IL-18蛋白表達(dá)水平明顯上升(P0.05),與mRNA檢測結(jié)果相符。進(jìn)一步證實(shí)黃連素可下調(diào)腸黏膜上皮細(xì)胞細(xì)胞因子IL-6、IL-23、IL-25和IL-33表達(dá)水平,提升IL-18表達(dá)水平。7、流式細(xì)胞術(shù)表面染色實(shí)驗(yàn)中,檢測到所提腸固有層淋巴細(xì)胞樣本中可圈出大量淋巴細(xì)胞(64.1%),其中CD3~+T細(xì)胞占46.1%,進(jìn)一步分群可見51.4%為CD3~+CD4~+T細(xì)胞,29.0%為CD3~+CD8~+T細(xì)胞,其分群合理�？勺C實(shí)所提細(xì)胞為腸固有層淋巴細(xì)胞。8、ELISA法檢測結(jié)果顯示,與DSS組小鼠相比,黃連素+DSS組小鼠腸固有層淋巴細(xì)胞IL-4表達(dá)水平明顯下降(P0.01)、IL-17A表達(dá)水平明顯下降(P0.05),而IFN-γ表達(dá)水平明顯上升(P0.001)、IL-10表達(dá)水平明顯上升(P0.05)。結(jié)果說明,在DSS誘導(dǎo)的急性腸炎中,應(yīng)用黃連素使LPL減少了Th2型和Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,增強(qiáng)了Th1型和Treg細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,與腸黏膜上皮細(xì)胞的此類細(xì)胞因子變化水平相類似。結(jié)論:1、在炎癥狀態(tài)下,黃連素可抑制腸黏膜上皮細(xì)胞細(xì)胞因子IL-6、IL-23、IL-25、IL-33的表達(dá)水平,提升IL-18的表達(dá)水平。2、黃連素可通過影響腸黏膜上皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子種類和水平,參與腸固有層淋巴細(xì)胞應(yīng)答,發(fā)揮免疫調(diào)理作用,減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠腸黏膜炎癥。
【圖文】：

3 結(jié)果黃連素使小鼠腸道炎癥程度減輕降率與疾病活動(dòng)指數(shù)的結(jié)果造模開始，每天稱量三組小鼠的體重、并觀察其大便形狀、便血等S 組小鼠相比，另兩組小鼠均出現(xiàn) IBD 癥狀。如圖 1.1 所示，從第SS 組小鼠體重明顯下降，并隨著天數(shù)增加體重持續(xù)下降。而黃連鼠第三天開始體重才略微下降，，并且體重下降幅度一直低于DSS組天開始黃連素+DSS 組與 DSS 組形成明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）黃連素+DSS組小鼠相比，存在活動(dòng)減少、體型消瘦、精神萎靡的泄稀便、血便情況比黃連素+DSS 組小鼠更為嚴(yán)重。疾病活動(dòng)指數(shù)，黃連素+DSS組與 DSS組形成明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文為進(jìn)一步分析小鼠腸管病變，我們解剖三組小鼠取出完整大腸，如圖 1.2所示，疾病模型小鼠較 PBS 組小鼠腸管相比，存在腸管明顯縮短、狹窄變形、腸腔內(nèi)稀便的情況，但黃連素+DSS 組腸管與 DSS 組腸管相比病變狀況較輕，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2683410