發(fā)布時間：2020-05-22 02:59

【摘要】：梔子是一味重要的中藥材,又名山梔子,是茜草科植物山梔的果實,其中梔子果實的主要有效成分為山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷和梔子苷等環(huán)烯醚萜苷類化合物。梔子和淡豆豉是傳統(tǒng)中藥配伍中的一對經(jīng)典藥對,廣泛應用于臨床研究中。其中,淡豆豉的主要活性成分為異黃酮。異黃酮是一種結構與雌激素相似的生物活性化合物,被稱為植物雌激素。課題組前期研究飲食中的異黃酮對淡豆豉體內(nèi)藥代動力學的影響時發(fā)現(xiàn)異黃酮可能通過調(diào)控腸道菌上調(diào)β-葡萄糖苷酶的活性從而促進糖苷向苷元的脫糖代謝。由于梔子中環(huán)烯醚萜苷的體內(nèi)代謝過程也受β-葡萄糖苷酶的調(diào)控,所以本文通過大鼠灌胃不同時間的異黃酮,研究了異黃酮對梔子中環(huán)烯醚萜苷成分藥代動力學特征的影響。為了分析梔子中主要環(huán)烯醚萜苷,首先建立了梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位中山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷和梔子苷三種環(huán)烯醚萜苷成分的定性定量分析方法。接著建立了大鼠口服梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位提取物后血漿中的山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷和代謝產(chǎn)物京尼平的定性定量分析方法。隨著異黃酮暴露時間的增加,研究腸道菌介導的腸代謝受影響的程度,并通過比較四種物質在異黃酮暴露不同時間的大鼠體內(nèi)的藥代動力學行為,研究了異黃酮對環(huán)烯醚萜苷在大鼠體內(nèi)藥代動力學的影響。本課題開展了以下五個方面的研究:一、梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位中三種環(huán)烯醚萜苷的定量分析本研究建立了一種同時測定梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位中三種環(huán)烯醚萜成分含量的LC-MS/MS法。該方法具有良好的選擇性、靈敏度、精密度,證明該方法適用于梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位中三種環(huán)烯醚萜苷的定量分析研究。色譜條件為反向C_(18)柱(100 mm×4.6 mm,5μm),使用梯度洗脫,流動相為0.1%乙酸水-0.1%乙酸乙腈(B),流速為0.4 ml/min,分析時間5 min;質譜條件為電噴霧離子化電離源,正離子(京尼平龍膽雙糖苷)和負離子(山梔苷和梔子苷)切換模式下進行多反應監(jiān)測。樣品符合線性關系(R0.999),并且精密度、準確度、加樣回收率、重復性和穩(wěn)定性試驗結果均符合要求。并且運用此方法,同時檢測了梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位中三種環(huán)烯醚萜苷成分的含量。二、梔子中三種環(huán)烯醚萜苷及其代謝產(chǎn)物在大鼠血漿中分析方法的建立與確證本研究建立了一種同時測定正常大鼠和不同時間異黃酮暴露大鼠口服梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位提取物后血漿中三種環(huán)烯醚萜苷及其代謝產(chǎn)物含量的LC-MS/MS法。經(jīng)過方法學驗證,其專屬性、線性關系、精確度、準確度、穩(wěn)定性等均符合要求。大鼠血漿采用固相萃取法進行前處理,以芍藥苷作為內(nèi)標物。色譜分析條件為Waters T3柱(150 mm×4.6 mm,3μm),流動相為0.06%乙酸水(A)-0.06%乙酸乙腈(B),梯度洗脫,流速為0.6 ml/min,分析時間為19 min;電噴霧離子源,正離子(京尼平龍膽雙糖苷)和負離子(山梔苷、梔子苷、京尼平和IS)切換模式下進行多反應監(jiān)測。經(jīng)過方法學驗證發(fā)現(xiàn),樣品符合線性關系(R0.99),日內(nèi)和日間精密度(RSD)均小于12.2%,準確度(RE)在-10.1%~16.4%之間,基質效應在81.2~89.2%范圍內(nèi),固相萃取提取回收率均大于53.8%。所以該方法可以用于大鼠血漿中環(huán)烯醚萜苷藥代動力學研究的測定。三、梔子中三種環(huán)烯醚萜苷及其代謝產(chǎn)物在正常SD大鼠的體內(nèi)藥代動力學研究利用如上建立的LC-MS/MS定性定量分析方法測定了正常大鼠單次口服給藥梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位提取物后體內(nèi)山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷和京尼平的血藥濃度,計算四種物質的藥代動力學參數(shù)(C_(max)、t_(1/2)、T_(max)、MRT、AUC_(0→t)和AUC_(0→∞)),繪制四種物質的藥時曲線圖,評價正常大鼠體內(nèi)梔子中環(huán)烯醚萜苷的藥代動力學行為。四、梔子中三種環(huán)烯醚萜苷及其代謝產(chǎn)物在不同時間的異黃酮暴露大鼠的體內(nèi)藥代動力學研究本實驗將正常SD大鼠平均分為4組,分別口服異黃酮提取物7天、14天、21天和28天后,單次口服給藥梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位提取物后,利用所建立的LC-MS/MS定性定量分析方法測定了4組經(jīng)異黃酮暴露大鼠單次口服給藥梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位提取物后體內(nèi)山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷和京尼平的血藥濃度,計算四種物質的藥代動力學參數(shù)(C_(max)、t_(1/2)、T_(max)、MRT、AUC_(0→t)和AUC_(0→∞)),繪制四種物質的藥時曲線圖,評價不同時間異黃酮處理大鼠體內(nèi)梔子中環(huán)烯醚萜苷的藥代動力學行為。五、異黃酮對梔子中環(huán)烯醚萜苷藥代動力特征影響的研究通過比較正常大鼠和不同異黃酮暴露時間的大鼠發(fā)現(xiàn),隨著異黃酮在大鼠體內(nèi)暴露的時間增加,山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷及其代謝產(chǎn)物京尼平的藥代動力學參數(shù)也在逐漸改變,并且其Ⅱ相代謝物京尼平硫酸鹽結合物也在在逐漸改變。這就提示,隨著異黃酮暴露時間的增加,腸道菌群可能發(fā)生變化,同時腸道菌調(diào)控的代謝酶活性可能也在發(fā)生變化。所以,當臨床上共同服用異黃酮和環(huán)烯醚萜苷時,不僅需要考慮藥物之間的相互作用,還需要考慮藥物對腸道菌介導的代謝的影響。
【圖文】：

2.4 標準曲線的繪制精密吸取“2.1.2”項下混和對照品溶液，分別逐級稀釋，按照“2.2”、“2.3”項下條件，進樣 2 μl，記錄各對照品的濃度。以各對照品的質量濃度（X，ng/ml）為橫坐標，峰面積值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得標準曲線方程，山梔苷：Y= 243.810X-289.957，r=0.9999，線性范圍 10.76～215.2 ng/ml；京尼平龍膽雙糖苷：Y= 137.125X+2092.76，r=0.9996，線性范圍 516～4128 ng/ml；梔子苷：Y= 2030.32X+823213，r=0.9998，線性范圍 2000～20000 ng/ml。以上結果表明，山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷在相應的濃度范圍內(nèi)線性關系良好。結果見表 1-1。質荷比 (m/z)圖 1-2 三種待測物的產(chǎn)物離子質譜圖（A. 山梔苷；B. 京尼平龍膽雙糖苷；C. 梔子苷）Fig 1-2 Product ion mass spectra of the analytes（A. shanzhiside；B. gentiobioside；3. geniposi

過 LC-MS/MS 技術，，建立一種對大鼠血漿中梔子三種環(huán)烯醚萜苷及其代謝產(chǎn)物的定性定量分析方法，利用固相萃取法對血漿樣品進行前處理，并通過方法學驗證，分別對專屬性、線性、精密度、準確度、基質效應、提取回收率以及穩(wěn)定性進行考察，以此為梔子中三種主要環(huán)烯醚萜苷及其代謝產(chǎn)物藥代動力學研究提供快速、可靠的分析手段。山梔苷 京尼平龍膽雙糖苷
【學位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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