【摘要】：目的:觀察藥物β-七葉皂苷鈉對(duì)信號(hào)適配器p62蛋白和自噬表達(dá)的影響以及p62蛋白和自噬在結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)β-七葉皂苷鈉化療敏感性的作用;探討p62蛋白影響結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)β-七葉皂苷鈉化療敏感性的機(jī)制。方法:CCK8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β-七葉皂苷鈉對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖作用的影響;Western blot檢測(cè)不同濃度不同時(shí)間β-七葉皂苷鈉對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞p62的影響;PCR檢測(cè)不同濃度β-七葉皂苷鈉對(duì)p62 m RNA水平的影響;Western blot檢測(cè)加入NAC后β-七葉皂苷鈉對(duì)p62表達(dá)的影響;Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)β-七葉皂苷鈉對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響;Western blot和細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)β-七葉皂苷鈉對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞DNA損傷的影響;采用質(zhì)粒FLAG-p62過表達(dá)和小干擾RNA干擾腫瘤細(xì)胞內(nèi)p62蛋白水平后,CCK8法檢測(cè)過表達(dá)和干擾p62聯(lián)合β-七葉皂苷鈉對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖活力的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過表達(dá)和干擾p62聯(lián)合β-七葉皂苷鈉對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響,Western blot檢測(cè)過表達(dá)和干擾p62聯(lián)合β-七葉皂苷鈉對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白和DNA損傷修復(fù)蛋白表達(dá)的影響;裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾p62表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌生長及其對(duì)β-七葉皂苷鈉化療療效的影響;使用ATM抑制劑聯(lián)合β-七葉皂苷鈉后,Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ATM抑制后β-七葉皂苷鈉對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響;Western blot檢測(cè)β-七葉皂苷鈉對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬的影響,CCK8和Western blot檢測(cè)干擾Atg5表達(dá)聯(lián)合β-七葉皂苷鈉對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和DNA損傷的影響。結(jié)果:(1)CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,β-七葉皂苷鈉以濃度依賴性和時(shí)間依賴性方式抑制HCT116和HCT8細(xì)胞的細(xì)胞活力和集落形成數(shù)。(2)β-七葉皂苷鈉作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生,Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示β-七葉皂苷鈉以濃度依賴性和時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)DNA損傷,同時(shí),Western blot結(jié)果顯示β-七葉皂苷鈉以相同方式上調(diào)p62,p62的上調(diào)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,并能被NAC部分消除。(3)β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的p62上調(diào)對(duì)β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的DNA損傷具有保護(hù)作用,因?yàn)槭褂脙煞Nsi RNA干擾p62表達(dá)后明顯增強(qiáng)β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的DNA損傷,而過表達(dá)p62減少β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的DNA損傷。(4)Western blot和流式細(xì)胞術(shù)顯示β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)濃度依賴性和時(shí)間依賴性的細(xì)胞凋亡;與DNA損傷結(jié)果類似,干擾p62表達(dá)增加β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制和凋亡,過表達(dá)p62降低β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制和凋亡。(5)通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),干擾p62表達(dá)抑制結(jié)直腸癌的生長,同時(shí)也增加其對(duì)β-七葉皂苷鈉的化療敏感性。(6)機(jī)制研究表明p62調(diào)控的DNA損傷與β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān),Western blot和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,干擾p62表達(dá)聯(lián)合ATM抑制劑KU55933增強(qiáng)了β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的DNA損傷并進(jìn)一步增加了β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。(7)Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)自噬水平激活,干擾Atg5表達(dá)抑制細(xì)胞自噬增加β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞增值抑制、DNA損傷和細(xì)胞凋亡。結(jié)論:(1)β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞細(xì)胞p62、自噬和DNA損傷以濃度依賴性和時(shí)間依賴性上調(diào)。(2)p62和自噬降低結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)β-七葉皂苷鈉的化療敏感性,其分子機(jī)制涉及細(xì)胞凋亡和DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。(3)p62介導(dǎo)的ATM/γH2AX信號(hào)通路和β-七葉皂苷鈉介導(dǎo)的自噬可能是β-七葉皂苷鈉發(fā)揮抗腫瘤作用的潛在靶標(biāo),為臨床上β-七葉皂苷鈉治療結(jié)直腸癌提供理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 2. β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。（A-B）β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡細(xì)胞經(jīng)過不同濃度 β-七葉皂苷鈉（0 60 μg/ml）作用 12 小時(shí)，，細(xì)胞凋亡數(shù)值通過式細(xì)胞儀分析，右方是細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)圖。（C-D）β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白上調(diào)細(xì)胞經(jīng)過不同濃度 β-七葉皂苷鈉（0 80 μg/ml）作用 12 小時(shí)或相同濃度 β-七葉皂

圖 3. β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo) p62 上調(diào)。（A）細(xì)胞經(jīng)過不同濃度 β-七葉皂苷鈉（0μg/ml）作用 12 小時(shí)或相同濃度 β-七葉皂苷鈉（60 μg/ml）作用不同時(shí)間（3-24 小時(shí)Western blot 檢測(cè) p62 蛋白的表達(dá)。（B）p62 蛋白的量化統(tǒng)計(jì)圖。（C）細(xì)胞經(jīng)過不濃度 β-七葉皂苷鈉（0 80 μg/ml）作用 12 小時(shí)，qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) p62 的 mRNA 水平
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285

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本文編號(hào)：2669863