【摘要】：背景:硬皮病(scleroderma)是一種在病理上以纖維化為主要特征的特殊類型的結(jié)締組織病,在臨床上它的主要特點是局灶性或彌漫性皮膚增厚,輕者病變范圍較為局限,重者可累及多系統(tǒng)、多臟器纖維化,與自身免疫、纖維化和血管病變等密切相關。目前沒有明確有效的治療方案。經(jīng)前期觀察,基于中醫(yī)玄府理論、以補肺清瘀為主要治法而創(chuàng)制的補肺清瘀顆粒有一定的臨床療效,對于其現(xiàn)代藥效物質(zhì)基礎及主要作用機制尚未完全闡明。研究目的:基于中醫(yī)玄府理論,以補肺清瘀為主要治法,分析研究補肺清瘀顆粒的物質(zhì)基礎;觀察補肺清瘀顆粒對硬皮病皮膚硬化的影響;應用高通量測序技術及生物信息學分析探索補肺清瘀顆粒治療硬皮病潛在的靶基因和相關蛋白,探討補肺清瘀顆粒治療硬皮病的作用機理,為網(wǎng)絡藥理學提供新的科學證據(jù)。研究方法:1)運用超高效液相色譜-四極飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometr,UHPLC-Q-TOF/MS)進行補肺清瘀顆粒的物質(zhì)基礎研究。制備供試品與標準品后,確定并選取合適的液相色譜、質(zhì)譜條件,采用UHPLC-Q-TOF/MS對該補肺清瘀顆粒復方中的代表性成分進行定性及定量分析。2)將小鼠隨機分組,正常組、BLM模型組、BLM+補肺清瘀顆粒劑量組,采用給小鼠背部皮膚連續(xù)皮下注射博來霉素溶液4周復制硬皮病模型,每日灌服中藥28天后,分別觀察補肺清瘀顆粒對正常組、模型組和補肺清瘀顆粒組小鼠的不同治療效果,評估其小鼠的整體健康情況并計算各臟器指數(shù),另外,取皮膚組織對其進行組織病理學分析,用堿水解法定量測定羥脯胺酸含量、酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法測定趨化因子(C-X-C基序)配體2(chemokine(C-X-C motif)ligand 2,Cxc12)含量、免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)測定α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA),綜合觀察并評估補肺清瘀顆粒對硬皮病小鼠動物模型改善皮膚硬化的作用。3)分別取正常組、模型組和補肺清瘀顆粒組小鼠皮膚組織用Trizol法提取總RNA,RNA樣本質(zhì)檢合格后富集mRNA,繼而進行mRNA文庫構(gòu)建并在Hiseq X Ten(Illumina)平臺上測序,隨后進行數(shù)據(jù)分析,主要包括:測序原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評估及質(zhì)控,RNAseq測序評估,基因表達量統(tǒng)計,差異表達基因篩選,差異表達基因韋恩圖,差異表達基因可視化分析(火山圖),蛋白互做網(wǎng)絡分析,差異基因熱圖,Unigene注釋(GO注釋、KEGG注釋),差異基因GO富集分析,差異基因KEGG富集分析。采用條件為log2 Fold Change|1,p-value0.05并且至少有一組平均TPM值≥5篩選出差異基因,并選擇三個預測的靶基因用Quantitative real-time PCR進行驗證,然后,通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析差異基因,并篩選出相應的信號通路,用Quantitative real-time PCR驗證信號通路上相應基因,此外,通過免疫印跡法驗證相關蛋白以綜合探討補肺清瘀顆粒對博來霉素誘導小鼠硬皮病模型改善皮膚硬化的分子機制。研究結(jié)果:1)補肺清瘀顆粒中皂苷類成分主要來自黃芪、黨參、桃仁、桔梗、凌霄花;酚酸類成分主要來自丹皮、當歸;丹參醌酮類成分主要來源于丹參;木脂素類成分在五味子中含量最高。2)與正常組比較,模型組小鼠雖然在不同時間點表現(xiàn)不完全相同,但總體趨勢顯示出精神萎靡,食量減少,蜷縮少動,體型減小,注射部位周圍毛發(fā)停止增長,皮膚變硬且厚,彈性差;脾指數(shù)顯著增加;羥脯胺酸含量明顯升高;病理上模型組出現(xiàn)了膠原纖維明顯增粗、數(shù)量增多、排列緊密、膠原間隙變窄、均質(zhì)化等改變以致真皮層明顯增厚,毛囊明顯減少,脂肪組織層變薄、消失,并伴有炎癥細胞浸潤的現(xiàn)象;Cxc12水平明顯升高;血管平滑肌陽性細胞數(shù)量增加。相較于模型組,補肺清瘀顆粒組小鼠精神尚可,取食、活動較多,皮膚硬化程度較輕;脾指數(shù)顯著減小;羥脯胺酸含量顯著降低;病理上看到膠原增生減少,真皮層厚度明顯減少,脂肪層變厚;Cxcl2水平明顯降低;血管平滑肌陽性細胞數(shù)量減少。3)通過轉(zhuǎn)錄組學分析,篩選出差異基因,用Quantitative real-time PCR對靶基因進行驗證,其中突觸體相關蛋白25(synaptosome associated protein 25,Snap25)和真核翻譯起始因子3,亞基J2(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit J2,Eif3j2)的表達倍數(shù)變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)一致,從一定程度上說明轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)是可靠性。通過KEGG通路分析篩選出信號通路,發(fā)現(xiàn)Notch信號通路是位列前五的富集顯著差異基因的通路,此外,在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上分別驗證了Notch-1和Jagged-2,我們進一步發(fā)現(xiàn)補肺清瘀顆�？梢燥@著降低Notch-1和Jagged-2的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平。研究結(jié)論:補肺清瘀顆粒中代表性的化學成分主要有四大類,皂苷類成分主要來自黃芪、黨參、桃仁、桔梗、凌霄花;酚酸類成分主要來自丹皮、當歸;丹參醌酮類成分主要來源于丹參;木脂素類成分在五味子中含量最高。補肺清瘀顆粒對博來霉素誘導的SSc小鼠模型有保護作用,還可以預防脾腫大的發(fā)生并對免疫系統(tǒng)起到保護作用。而且,補肺清瘀顆粒在組織病理學和羥脯胺酸含量上都顯示出阻止皮膚硬化發(fā)展的趨勢,這機制部分可能是通過部分影響Cxcl2或中性粒細胞的參與、血管相關以及Notch信號通路等方面實現(xiàn)的。
【圖文】：

邋ｍｉｎ逡逑圖３．１－１補肺清瘀顆粒中代表性化合物標準品的提取離子流圖（Ａ為正離子模式，Ｂ為負逡逑離子模式）。１、苦杏仁苷；２、丹皮酚；３、五味子醇甲；４、二氫丹參酮Ｉ邋；邋５、隱丹參酮；逡逑６、五味子甲素；７、丹參酮ＩＩＡ；邋８、五味子乙素；９、丹參素；１０、毛蕊花糖苷；１１、阿逡逑魏酸；１２、黨參炔苷；１３、}P梗皂苷Ｄ；邋１４、黃芪甲苷。逡逑

邋ｍｉｎ逡逑３．１－２補肺清瘀顆粒水溶液中代表性化合物的提取離子流圖（Ａ為正離子模式，Ｂ為子模式）。１、苦杏仁苷；２、丹皮酚；３、五味子醇甲；４、二氫丹參酮Ｉ邋；邋５、隱丹參酮；逡逑五味子甲素；７、丹參酮ＩＩＡ；邋８、五味子乙素；９、丹參素；１０、毛蕊花糖苷；１１、魏酸；１２、黨參炔苷；１３、桔梗皂苷Ｄ；邋１４、黃芪甲苷。逡逑利用ＴＯＦ／ＭＳ中準分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)與文獻數(shù)據(jù)進行對比定性，，結(jié)果如１－２所示；補肺清瘀顆粒水溶液進樣后，提取出的１４個標準物質(zhì)的色譜峰如圖３．１－２，定量結(jié)果如表３．１－３所示。逡逑
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2665248