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基于下調(diào)IDO1表達的川楝素及新型小檗堿衍生物抗腫瘤作用及機制研究

發(fā)布時間:2020-05-11 16:00
【摘要】:吲哚胺2,3-雙加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)是色氨酸分解代謝的第一限速酶,可通過介導色氨酸的耗竭及其代謝產(chǎn)物犬尿氨酸的積累來誘導T細胞和NK細胞的凋亡或功能紊亂,從而減弱機體的抗腫瘤免疫。因此,IDO1被認為是腫瘤免疫治療藥物的一個重要靶標。同時,作為有廣闊發(fā)展前景的免疫治療候選藥物,吲哚胺2,3-雙加氧酶1抑制劑,如Epacadostat和Indoximod等已經(jīng)進入臨床試驗。尤其值得關(guān)注的是,小分子IDO1抑制劑與PD-1抗體的結(jié)合可以顯著提高腫瘤治療的客觀反應率(ORR,objective response rate)。由于它是一種具有良好生物化學作用的單鏈催化酶,因此,IDO1被認為是小分子免疫治療發(fā)展的一個極具吸引力的靶點。開發(fā)新型IDO1小分子抑制劑將會對臨床腫瘤免疫治療的發(fā)展產(chǎn)生積極影響。在第一部分實驗中,為了發(fā)現(xiàn)和探索新型的靶向IDO1的小分子免疫治療藥物,我們通過PCR實驗擴增人IDO1啟動子上游區(qū)域1245 bp基因片段,將其插入到pGL4.20-basic載體中構(gòu)建了 pGL4-IDO1-luc熒光素酶重組質(zhì)粒。基于雙熒光素酶報告基因方法建立IDO1抑制劑篩選模型,篩選能夠下調(diào)腫瘤細胞中IDO1表達的天然活性小分子化合物。采用MTT、Western blotting和LDH等方法探討陽性化合物的抗腫瘤作用及其對IDO1的調(diào)控機制。化合物川楝素(toosendanin,NS-180)能顯著下調(diào)IFN-γ誘導的腫瘤細胞中IDO1表達而不能直接抑制IDO1的酶活性。在A549細胞中,川楝素可抑制IFN-γ誘導的STAT1的磷酸化和核轉(zhuǎn)位,從而在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)IFN-γ誘導的IDO1蛋白表達。細胞阻抗分析和LDH釋放實驗表明,川楝素可促進NK淋巴細胞對A549細胞的殺傷作用。綜上所述,篩選獲得的天然小分子川楝素是一類新型高效的IDO1抑制劑,它可能成為靶向IDO1的腫瘤免疫治療候選藥物。在第二部分實驗中,為了發(fā)現(xiàn)和探索新型的靶向IDO1的小分子免疫治療藥物,我們首先設計合成了一系列新型的小檗堿(berberine,BBR)衍生物,包括酯類、酰胺類和磺酸類化合物。以IDO1為靶點對BBR衍生物的活性進行了研究,檢測其是否抑制IFN-γ誘導的IDO1啟動子熒光素酶活性。構(gòu)效關(guān)系分析表明,在位置9使用叔碳、季碳或者剛性結(jié)構(gòu)基團進行取代,可能有利于增強其對IDO1啟動子活性的抑制效力。與BBR相比,2f、2i、2n、2o、8b等化合物對IDO1啟動子熒光素酶活性有較好的抑制作用,抑制率約為71-90%。Western blot實驗進一步驗證了它們在蛋白水平抑制IDO1的表達。而且,化合物2i和2n通過增強NK淋巴細胞對A549細胞的殺傷作用顯示了其抗癌活性,這種抗癌活性是由于靶向下調(diào)IDO1的表達,而不是因為化合物本身對A549細胞的細胞毒性作用。初步的機制研究顯示化合物2i和2n能夠通過激活AMPK,抑制STAT1磷酸化,從而在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)IFN-γ誘導的IDO1表達。因此,我們認為化合物2i和2n是一種很有前途的新型的IDO1抑制劑,它們可能對臨床腫瘤免疫治療的發(fā)展產(chǎn)生積極影響。
【圖文】:

序列,啟動子,結(jié)合位點,質(zhì)粒


ID01基因啟動子包含了邋ATG起始密碼子結(jié)合位點,包括兩個相距1000邋ntGAS序列、兩個AP-1結(jié)合位點。ID01可分別直接或者間接地激活IDOl基因過PCR擴增了這段1245bp的IDOl組為模板,進行PCR,擴增產(chǎn)物經(jīng)1%異性目的條帶,與預計相符,表明已獲取的IDOl基因片段與空白質(zhì)粒PGL4行雙酶切。隨后將雙酶切后回收的IDNA連接酶進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進取質(zhì)粒進行隨后的酶切鑒定。逡逑bp邋M邐1逡逑

序列,限制性內(nèi)切酶,重組質(zhì)粒,啟動子區(qū)


對重組PGL4-ID014UC質(zhì)粒的插入片段進行測序,結(jié)果表明各酶切位點正確,逡逑經(jīng)比對后證實測序序列與GeneBank中報道的ID01啟動子區(qū)序列相符。選取逡逑pGL4-ID01-luc測序的部分截圖(圖3N3),下劃線序列為上游引物,表明重組質(zhì)逡逑粒pGL4-ID01-luc構(gòu)建成功。對測序得到的ID01啟動子區(qū)進行序列分析發(fā)現(xiàn),,該逡逑啟動子區(qū)含有干擾素刺激反應兀件1邋/2邋(interferon邋stimulation邋reaction邋element,逡逑26逡逑
【學位授予單位】:北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2018
【分類號】:R285.5

【參考文獻】

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本文編號:2658712


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