蟲草素誘導(dǎo)腎透明細(xì)胞癌凋亡和抑制其遷移能力的研究

發(fā)布時(shí)間：2020-05-09 05:00

【摘要】：背景腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是指起源于腎臟上皮細(xì)胞的癌癥,在腎臟惡性腫瘤中占比超過90%,包含了超過10種以上的組織病理學(xué)及分子病理學(xué)的亞型,其中腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,cc RCC)是最常見的病理類型,研究表明,大約75%的腎細(xì)胞癌是腎透明細(xì)胞癌。流行病學(xué)調(diào)查表明,在過去的20多年中,腎細(xì)胞癌全球發(fā)病率每年增加2%;世界范圍內(nèi),腎細(xì)胞癌年齡標(biāo)化患病率和死亡率分別是每10萬人6人患病和每10萬人2.1人死亡。盡管腎細(xì)胞癌診療技術(shù)取得很大進(jìn)展,大約有20%~30%的腎細(xì)胞癌患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的腎細(xì)胞癌患者預(yù)后較差,5年存活率大約8%。隨著對腎細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制認(rèn)識的加深,近年來發(fā)展出了腎細(xì)胞癌的免疫療法和靶向療法,但是到目前為止,沒有一種藥物能夠取得100%的反應(yīng)率和疾病的持久的緩解,對腎細(xì)胞癌的治療仍需要發(fā)展新的輔助療法。中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)(Chinese traditional medicine,CTM)為現(xiàn)代西方醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供了一種替代的路徑,特別是其中的中草藥(herbal medicine),近年來在治療許多慢性疾病包括腫瘤等方面中草藥及其提取的活性成分得到越來越多的關(guān)注和研究。蟲草素(cordycepin)是從中國傳統(tǒng)中藥冬蟲夏草(Cordyceps militaris)中提取的主要活性成分,過去在肺癌、乳腺癌、卵巢癌和白血病等腫瘤中的的研究表明,蟲草素具有廣譜的抗腫瘤活性,但蟲草素在腎細(xì)胞癌中的抗腫瘤活性及其作用的相關(guān)分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。目的探討蟲草素(cordycepin)對腎透明細(xì)胞癌存活、遷移能力的影響,并初步研究蟲草素在腎透明細(xì)胞癌中抗腫瘤作用的分子機(jī)制,為未來蟲草素輔助治療在腎細(xì)胞癌方面的潛在臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。方法1.不同濃度(10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml,50μg/ml)蟲草素處理Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞48小時(shí),CCK-8(cell counting kit-8)細(xì)胞活力檢測試劑測定細(xì)胞存活情況;Caspase-3半胱天冬酶活性測定試劑盒測定細(xì)胞中Caspase-3活性。2.30μg/ml的蟲草素和50μmol/L的半胱天冬酶抑制劑z-VAD-fmk同時(shí)處理Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞48小時(shí),設(shè)空白對照和半胱天冬酶抑制劑z-VADfmk未處理對照,CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒測定細(xì)胞活力;Western Blot技術(shù)檢測凋亡標(biāo)志蛋白PARP(poly ADP-ribose polymerase)和caspase-3的切割。3.Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)分析10μg/ml的蟲草素處理24小時(shí)和48小時(shí)對Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞遷移能力的影響。4.10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml的蟲草素處理Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞,Western Blot技術(shù)檢測蟲草素對磷酸酶PTEN(Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10)水平、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt磷酸化水平的影響;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,Q-PCR)檢測蟲草素處理對Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中micor-RNA-21(mi R-21)表達(dá)水平的影響。5.通過轉(zhuǎn)染mi R-21 mimic或者PTEN小干擾RNA(small interfering RNA,si RNA)在Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中降低PTEN表達(dá),Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PTEN敲低表達(dá)效果,CCK-8細(xì)胞活力測定試劑盒測定在Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中敲低PTEN表達(dá)對蟲草素促進(jìn)Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡性死亡的影響;Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測在Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中敲低PTEN表達(dá)對蟲草素抑制Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果1.CCK-8細(xì)胞活力測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照相比,10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml,50μg/ml蟲草素處理Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞48小時(shí),Caki-1細(xì)胞活力明顯下降(P0.05 vs.對照),呈濃度依賴模式;隨著蟲草素處理濃度的逐漸升高,Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞裂解液中凋亡標(biāo)志物caspase-3蛋白活性逐漸升高(P0.05 vs.對照)。在50μmol/L的半胱天冬酶抑制劑z-VAD-fmk存在的情況下,蟲草素(30μg/ml)誘導(dǎo)的Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞死亡被顯著抑制(P0.05);Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示30μg/ml蟲草素處理Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白PARP的切割和caspase-3半胱天冬酶的切割激活,而50μmol/L的半胱天冬酶抑制劑z-VAD-fmk處理可以顯著抑制PARP和caspase-3蛋白的切割。2.Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照相比,10μg/ml的蟲草素處理能顯著抑制Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的跨膜遷移(P0.05 vs.對照)。3.Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對照相比,10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml的蟲草素處理Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞能顯著上調(diào)PTEN表達(dá)水平(P0.05 vs.對照)和下調(diào)蛋白激酶Akt磷酸化水平(P0.05 vs.對照),且呈一定的濃度依賴的模式。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,與對照相比,隨著蟲草素作用濃度(10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml)的升高,Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞mi R-21表達(dá)水平逐漸降低(P0.05 vs.對照)。4.Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mi R-21mimic或者PTEN si RNA均可降低PTEN蛋白表達(dá)水平;CCK-8細(xì)胞活力測定結(jié)果表明,mi R-21 mimic或者PTEN si RNA轉(zhuǎn)染Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞均可抑制30μg/ml的蟲草素處理誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(P0.05);Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,mi R-21 mimic或者PTEN si RNA轉(zhuǎn)染Caki-1腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞均可減弱10μg/ml的蟲草素處理對細(xì)胞遷移的抑制(P0.05)。結(jié)論蟲草素(cordycepin)處理腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系Caki-1細(xì)胞可降低mi R-21表達(dá),升高PTEN磷酸酶表達(dá);通過調(diào)控mi R-21和PTEN表達(dá)水平,蟲草素可誘導(dǎo)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系Caki-1的凋亡性細(xì)胞死亡,抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系Caki-1的遷移能力;蟲草素在治療腎細(xì)胞癌方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：