納豆激酶體內(nèi)藥效和毒性研究

發(fā)布時間：2020-05-08 00:01

【摘要】：納豆激酶(nattokinase,NK)是由納豆枯草桿菌(Bacillus subtilis natto),在納豆發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種具有強(qiáng)烈纖溶作用的絲氨酸蛋白酶。研究表明納豆激酶不僅易于提取純化,成本低廉,溶栓效果好,藥效時間長,而且安全性好,為解決目前抗血栓類藥物的口服性差,價格昂貴、并發(fā)癥多等問題帶來更多希望。本文通過應(yīng)用實驗室分離到的高產(chǎn)納豆激酶菌株(Bacillus subtilis natto LNUB236)經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng),以發(fā)酵液為原料,采用硫酸銨沉淀納豆激酶,將離心后的沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解,得到的納豆激酶粗酶液,進(jìn)行兩次Sephadex G-75凝膠層析,收集到的納豆激酶活性組分經(jīng)過冷凍干燥得到凍干粉,并定量將凍干粉裝入大鼠專用腸溶膠囊,以口服納豆激酶腸溶膠囊的給藥方式來評價納豆激酶在體內(nèi)的藥效作用、體內(nèi)急性毒性和長期毒性,為納豆激酶的臨床應(yīng)用和產(chǎn)品開發(fā)提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。納豆激酶抗血栓的作用評價是通過構(gòu)建SD大鼠體內(nèi)血栓模型以及對小鼠尾部出血時間的影響進(jìn)行評價。體內(nèi)藥效表明,FeCl_3誘導(dǎo)的大鼠頸動脈血栓實驗中,與對照組相比,納豆激酶5000 IU/kg、10000 IU/kg、15000 IU/kg劑量組均能夠有效抑制大鼠頸動脈血栓的形成(P0.0001),且具有劑量依賴性。在小鼠尾部出血實驗中,與對照組相比,5000 IU/kg、10000 IU/kg、15000 IU/kg劑量組均能顯著延長出血時間(P0.0001),且隨著給藥劑量的增加出血時間更長(P0.0001),具有劑量依賴性。觀察納豆激酶對SD大鼠的急性毒性和長期毒性,為臨床用藥安全提供參考。納豆激酶急性毒性實驗中,一次給藥5000 mg/kg,并連續(xù)觀察14天,記錄毒性反應(yīng)和死亡情況。急性毒性實驗中無毒性反應(yīng)和死亡發(fā)生,實驗結(jié)果表明納豆激酶的LD_(50)5000 mg/kg,無急性中毒的危險性。在長期毒性實驗中,觀察大鼠重復(fù)28天給予納豆激酶毒性反應(yīng),將大鼠隨機(jī)分成4組,分別為對照組、納豆激酶120 mg/kg、360 mg/kg、1000 mg/kg給藥劑量組,重復(fù)給藥28天,試驗期間每天觀察大鼠的外觀體征、行為活動,并在實驗結(jié)束采集血樣進(jìn)行血液學(xué)、血液生化學(xué)、凝血指標(biāo)及病理組織學(xué)檢查。納豆激酶重復(fù)給藥28天,給藥期間大鼠生長發(fā)育良好,行為活動正常,各項指標(biāo)檢測均未發(fā)現(xiàn)異常,本實驗中未發(fā)現(xiàn)與納豆激酶毒性相關(guān)的異常改變,納豆激酶經(jīng)口服給藥28天對大鼠無明顯毒性。納豆激酶重復(fù)給藥90天的毒性實驗中,大鼠隨機(jī)分為4組,分別為對照組、納豆激酶120mg/kg、360 mg/kg、1000 mg/kg給藥劑量組,重復(fù)給藥90天,給藥期間觀察大鼠的一般狀態(tài),給藥結(jié)束后大鼠分別進(jìn)行血液學(xué)、血液生化學(xué)、凝血指標(biāo)和病理組織檢查。實驗期間各給藥組大鼠的外觀體征,行為活動,糞便等均正常,各項指標(biāo)檢查均未發(fā)現(xiàn)異常。本實驗條件下,未發(fā)現(xiàn)納豆激酶毒性引起的異常改變,納豆激酶經(jīng)口給藥90天對大鼠無明顯毒性。
【圖文】：

標(biāo)準(zhǔn)曲線,酶活,標(biāo)準(zhǔn)曲線,尿激酶

第 1 章納豆激酶的制備實驗結(jié)果.1 酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制納豆激酶活性是折算成尿激酶的活性單位表示的，以尿激酶活性為橫坐標(biāo)，蛋白平板溶解圈面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線。實驗得到的尿激性和溶解圈直徑乘積的對數(shù)如表 1-2所示。表 1-2 酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線激酶酶活(IU/mL) 20 40 60 80 100 160 320徑乘積的對數(shù) 2.13 2.18 2.17 2.22 2.23 2.32 2.52以尿激酶活性為橫坐標(biāo)，，溶解圈直徑乘積的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制酶活標(biāo)準(zhǔn)曲如圖 1-1 所示。

納豆激酶,凝膠層析,圖譜,纖溶活性