發(fā)布時(shí)間：2020-05-04 23:36

【摘要】：目的:研究積雪草酸(AA)作用后對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響,并對(duì)差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,通過GO功能注釋、KEGG通路富集分析和PPI差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建,結(jié)合相應(yīng)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)的初步驗(yàn)證,探討積雪草酸抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的作用方式及潛在機(jī)制。方法:1.以人肝癌SMMC-7721細(xì)胞為研究對(duì)象,MTT實(shí)驗(yàn)分析AA(20、30、40、50、60μM)作用24h后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用,并計(jì)算IC_(50)值,以該濃度進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)。2.采用體外i TRAQ標(biāo)記結(jié)合納升液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)獲得AA作用后的蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)。并利用Proteome Discoverer軟件篩選差異蛋白表達(dá)譜。差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能注釋分析、KEGG通路富集分析,并利用Omicsbean在線軟件對(duì)差異富集通路中的差異蛋白進(jìn)行PPI蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行AA抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的作用方式與作用機(jī)制的生物信息學(xué)分析。3.采用Western blot方法對(duì)生物信息學(xué)分析所得的關(guān)鍵差異蛋白富集通路中的線粒體凋亡相關(guān)差異蛋白(Bax、Cyt C、Caspase-3、Cleaved Caspase-3)的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證,對(duì)m TOR-4EBP1自噬通路中相關(guān)差異蛋白(LC3-I/II、m TOR、p-m TOR、4EBP1、p-4EBP1)的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。4.結(jié)合AA誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)發(fā)生差異的結(jié)論,通過Hoechst 33342/PI雙染法進(jìn)行凋亡染色實(shí)驗(yàn)和MDC法自噬囊泡染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確AA誘導(dǎo)凋亡和自噬的產(chǎn)生,并聯(lián)用自噬抑制劑3-MA以明確AA誘導(dǎo)的自噬對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果:1.AA作用24h后能夠劑量依賴性地抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖,IC_(50)為37.31μM。綜合考慮后,本研究選用40μM的AA濃度進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析等實(shí)驗(yàn)。2.運(yùn)用i TRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選40μM的AA作用24h后人肝癌SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)的差異蛋白結(jié)果顯示,AA干預(yù)后引起495個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白及141個(gè)表達(dá)下調(diào)的差異蛋白。生物信息學(xué)分析表明這些差異蛋白主要參與到細(xì)胞能量代謝活動(dòng)中,包括氧化磷酸化通路、糖酵解/糖異生通路和果糖及甘露糖代謝通路。深入分析后發(fā)現(xiàn),這些細(xì)胞代謝相關(guān)通路蛋白的表達(dá)變化可能主要是由AA誘導(dǎo)的線粒體凋亡和通過負(fù)調(diào)控m TOR-4EBP1通路誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬而引起的,進(jìn)而影響細(xì)胞的正常能量代謝活動(dòng)并抑制其增殖。3.Western blot驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,40μM的AA干預(yù)后可以明顯上調(diào)Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3、4EBP1和LC3-II的蛋白表達(dá),下調(diào)Caspase-3、p-m TOR、p-4EBP1的表達(dá),與差異蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。提示AA可誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞產(chǎn)生線粒體凋亡和自噬。4.對(duì)AA作用后的人肝癌SMMC-7721細(xì)胞使用Hoechst 33342/PI雙染法進(jìn)行凋亡染色和MDC法進(jìn)行自噬囊泡染色后發(fā)現(xiàn),40μM的AA可明顯引起凋亡細(xì)胞數(shù)和自噬囊泡數(shù)的增加,進(jìn)一步證實(shí)了AA可誘導(dǎo)凋亡和自噬。當(dāng)40μM的AA聯(lián)用自噬抑制劑3-MA時(shí),AA對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用可部分消失,提示AA誘導(dǎo)的自噬和線粒體凋亡共同引起了肝癌細(xì)胞的增殖抑制。結(jié)論:1.積雪草酸作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞24h后可以劑量依賴性的抑制細(xì)胞的體外增殖,主要表現(xiàn)為細(xì)胞正常能量代謝相關(guān)通路受到影響,與受到細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)通路差異蛋白的調(diào)控有關(guān)。2.積雪草酸可影響線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白的表達(dá),誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞產(chǎn)生凋亡,同時(shí)影響m TOR-4EBP1通路自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),誘導(dǎo)自噬抑制細(xì)胞的體外增殖。
【圖文】：

圖 1 積雪草酸（Asiatic acid，，AA）0H48O5，2α, 3β, 23-三羥基-烏蘇烷型-12-烯-28在天然活性產(chǎn)物的研究中具有明顯細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)表達(dá)變化[11]。同位合納升液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜（Na公司研發(fā)的一種基于體外等重同位最準(zhǔn)確的一種高通量定量蛋白質(zhì)位素試劑標(biāo)記多肽末端氨基或賴氨分析，使得帶不同同位素標(biāo)簽的同子，根據(jù)報(bào)告離子的豐度可獲得樣處理得到蛋白質(zhì)的定量信息可同時(shí)

學(xué)技術(shù)分析積雪草酸抑制人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制 肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞體外增殖活性的影示，MTT 結(jié)果顯示積雪草酸（20、30、4依賴性地抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的積雪草酸抑制人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞胞活力下降 50%左右，積雪草酸對(duì) SMM，同時(shí)也仍存有足夠數(shù)量的細(xì)胞可以進(jìn)行提取。根據(jù) IC50值綜合考慮后，本實(shí)驗(yàn)選 SMMC-7721 細(xì)胞 24h 進(jìn)行后續(xù)的蛋白質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285

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