【摘要】：背景肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性疾病之一,嚴(yán)重威脅人類的健康,發(fā)現(xiàn)新型有效的安全藥物是目前肺癌治療的急迫需要和研究動(dòng)力。蟾酥,是從蟾蜍的皮膚和腮腺中提取的乙醇萃取物,在我國傳統(tǒng)的抗癌治療中應(yīng)用廣泛。華蟾酥毒基(Cinobufagin,CnBu),是最新發(fā)現(xiàn)的從中華大蟾蜍的皮膚上提取的生物活性成分,被報(bào)道證實(shí)具有多種藥理作用,是蟾酥的活性成分之一,對(duì)多種人類腫瘤細(xì)胞株有廣譜細(xì)胞毒性,具有新型抗腫瘤活性。但是CnBu在人肺癌細(xì)胞的體內(nèi)效應(yīng)和作用機(jī)制尚未明確,相關(guān)的可行性實(shí)驗(yàn)非常少。目的在本實(shí)驗(yàn)中,我們通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)初步探討CnBu在肺癌細(xì)胞中的抗癌活性及機(jī)制,旨在為CnBu的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)以及參考。方法(1)使用CnBu、沙蟾毒精和蟾毒靈對(duì)人肺癌細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行處理后,使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。加入CnBu孵育24-48小時(shí)后,通過人工計(jì)數(shù)確定細(xì)胞遷移數(shù)。我們采用Transwell Boyden小室評(píng)估CnBu對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響。加入CnBu孵育24小時(shí)后,使用姬姆薩染色,通過人工計(jì)數(shù)定量侵襲細(xì)胞數(shù)。(2)我們應(yīng)用TUNELDAPI聯(lián)合染色試驗(yàn)試劑盒檢測(cè)CnBu誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。經(jīng)測(cè)試藥物處理后,使用特殊的Caspase底物及熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性。熒光顯微鏡及線粒體特異性探針(MitoTracker Red CMXRos)分析CnBu處理后A549細(xì)胞中線粒體形態(tài)的改變。DHE熒光探針分析ROS在各組細(xì)胞內(nèi)的含量,并對(duì)比加與不加ROS的清除劑NAC預(yù)處理的各組細(xì)胞的活力變化。(3)我們將A549細(xì)胞注射到雄性裸鼠右后脅,10天后,對(duì)裸鼠注射CnBu 28天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)將移植瘤切除并稱重、測(cè)量尺寸;每個(gè)組織分別切片脫蠟HE染色,形態(tài)學(xué)檢測(cè)及組織學(xué)觀察,TUNELDAPI共染色試驗(yàn)檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞切片凋亡情況;免疫熒光染色分析磷酸化p53免疫熒光成像。采用QW550圖像分析軟件半定量分析Ki67蛋白和磷酸化p53的表達(dá)。結(jié)果(1)結(jié)果提示,CnBu在肺癌細(xì)胞中較蟾毒靈和沙蟾毒精表現(xiàn)出更高的抗癌效果,IC50值范圍為2.3-6.7μM。同時(shí),CnBu比對(duì)照細(xì)胞表現(xiàn)出更低的毒性,IC50值為22.3μM,提示CnBu對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞有較高的選擇性。CnBu同時(shí)表現(xiàn)出與劑量相關(guān)的阻礙A549細(xì)胞遷徙、入侵的特性。(2)此外,CnBu的處理提高肺癌細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性,有效地誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡�？拱┲委燂@著激活線粒體的裂解和ROS過度產(chǎn)生。有趣的是,抗氧化劑的添加明顯減少CnBu誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,這一結(jié)果顯示ROS在CnBu誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中的重要作用。(3)最后,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,我們的結(jié)果顯示CnBu的處理誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞凋亡,上調(diào)了細(xì)胞增殖的生物標(biāo)志物Ki-67蛋白及磷酸化的重要抗癌因子p53蛋白的表達(dá)。這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了 CnBu的抗癌功能。結(jié)論我們的研究結(jié)果顯示CnBu可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及提高磷酸化的p53蛋白的表達(dá)起到抑癌作用。
【圖文】：

癌細(xì)胞邐正常細(xì)胞逡逑圖１－２華蟾酥毒基、蟾毒靈、蟾酥的體外抗癌活性逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ邋ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋Ｃｉｎｏｂｕｆａｇｉｎ邋（ＣｎＢｕ），邋Ｂｕｆａｌｉｎ邋（Ｂｕ）邋ａｎｄ逡逑Ａｒｅｎｏｂｕｆａｇｉｎ邋（ＡｒＢｕ）．逡逑２抑制肺癌細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè)結(jié)果逡逑鑒于Ａ５４９細(xì)胞系對(duì)華蟾酥毒基的處理最為敏感，我們后續(xù)的研宄選取這逡逑一細(xì)胞系對(duì)華蟾酥毒基的作用特性及機(jī)理作進(jìn)一步的研宄。首先，鑒于肺癌細(xì)逡逑胞具有轉(zhuǎn)移性，，我們檢測(cè)了華蟾酥毒基對(duì)肺腺癌Ａ５４９細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的抑制作逡逑用。我們通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ邋ｍｉｇｒａｔｉｏｎ邋ａｓｓａｙ）分析華蟾醉毒基對(duì)Ａ５４９逡逑細(xì)胞是否具有抗轉(zhuǎn)移能力。我們首先確定在高細(xì)胞密度下（ｌｘｌＯ６／每孔），０．５｜ｉＭ逡逑２１逡逑

ｉｃ邐￣ｃ逡逑圖１－１在反相高效液相色譜儀（安捷倫１１００系列）上所檢測(cè)的華蟾酥毒基的吸收峰逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ邋ＨＰＬＣ邋ｔｒａｃｅｓ邋ｆｏｒ邋ｃｉｎｏｂｕｆａｇｉｎ邋ｏｎ邋Ａｇｉｌｅｎｔ邋１１００邋ｓｅｒｉｅｓ邋ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ．逡逑４０邋＿邋＾ＨＣｎＢｕ邐Ｔ逡逑WＢｕ逡逑ＨＡｒＢｕ逡逑ｒ邐Ｊ逡逑Ａ５４９邋ＮＣＩ－Ｈ４６０邋Ｈ１２９９邋Ｓｋ－ｍｅｓ－１邋Ｃａｌｕ－３邋ＢＥＡＳ－２Ｂ逡逑癌細(xì)胞邐正常細(xì)胞逡逑圖１－２華蟾酥毒基、蟾毒靈、蟾酥的體外抗癌活性逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ邋ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋Ｃｉｎｏｂｕｆａｇｉｎ邋（ＣｎＢｕ），邋Ｂｕｆａｌｉｎ邋（Ｂｕ）邋ａｎｄ逡逑Ａｒｅｎｏｂｕｆａｇｉｎ邋（ＡｒＢｕ）．逡逑２抑制肺癌細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè)結(jié)果逡逑鑒于Ａ５４９細(xì)胞系對(duì)華蟾酥毒基的處理最為敏感，我們后續(xù)的研宄選取這逡逑一細(xì)胞系對(duì)華蟾酥毒基的作用特性及機(jī)理作進(jìn)一步的研宄。首先，鑒于肺癌細(xì)逡逑胞具有轉(zhuǎn)移性，我們檢測(cè)了華蟾酥毒基對(duì)肺腺癌Ａ５４９細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的抑制作逡逑用。我們通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ邋ｍｉｇｒａｔｉｏｎ邋ａｓｓａｙ）分析華蟾醉毒基對(duì)Ａ５４９逡逑細(xì)胞是否具有抗轉(zhuǎn)移能力。我們首先確定在高細(xì)胞密度下（ｌｘｌＯ６／每孔），０．５｜ｉＭ逡逑２１逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2646007